基于机器学习和WGCNA整合分析揭示陆地棉抗黄萎病关键基因调控网络

本研究通过时间序列转录组测序（RNA-Seq）结合加权基因共表达网络分析（WGCNA）和机器学习算法（LASSO/RF/SVM），系统解析了陆地棉（Gossypium hirsutum）响应大丽轮枝菌（Verticillium dahliae）侵染的动态转录调控机制，鉴定出GhRLP6、GhCIPK6、GhCBP60A等核心抗病基因，为棉花抗黄萎病分子育种提供重要靶点。

　　

1 引言
黄萎病作为由大丽轮枝菌（Verticillium dahliae）引起的土传病害，严重威胁全球棉花（Gossypium hirsutum）生产。该病原菌能以微菌核形态在土壤中存活超过14年，通过根系侵染植株维管系统，导致叶片萎蔫、脱落甚至整株死亡。由于化学防治效果有限，培育抗病品种成为最经济有效的防控手段。近年研究发现，NBS-LRR类抗病基因（如GbaNA1、GhDSC1）和受体激酶（如GhRLCK-VII、GhWAK7A）通过激活ETI（效应子触发免疫）和PTI（病原相关分子模式触发免疫）通路参与抗病过程，而苯丙烷和类黄酮代谢途径也贡献重要化学防御机制。然而，陆地棉抗黄萎病的多基因协同调控网络仍有待系统解析。

2 材料与方法
研究选用感病品种冀棉11（Jimian 11），在水培体系中接种1×10⁶ spores/mL大丽轮枝菌孢子悬浮液，分别于接种后0、12、24、48 h采集根和叶组织进行RNA-seq。使用DESeq2鉴定差异表达基因（DEGs），通过Mfuzz聚类分析时间表达模式，并采用WGCNA构建共表达网络。为筛选核心基因，创新性整合LASSO回归、随机森林（RF）和支持向量机（SVM）三种机器学习算法进行特征选择，最终通过qRT-PCR验证关键基因表达模式。

3 结果
3.1 组织特异性响应模式
PCA分析显示根与叶组织呈现明显转录组差异。根系在接种12 h即出现5,128个上调基因和3,757个下调基因，显著多于叶片（2,761上调和765下调），表明根系作为病原入侵门户率先启动防御。GO分析发现早期（12 h）根系基因富集于"RNA聚合酶II转录因子活性"和"糖酵解过程"，而后期（48 h）则转向"钙调素结合"和"细胞壁组织"等通路。

3.2 时序表达聚类
根系基因被划分为6个簇（C1-C6），其中C3（5,113基因）和C5（7,023基因）呈现持续上调模式，显著富集于"防御反应"、"活性氧代谢"和"激素信号通路"。值得注意的是，C3基因簇包含多个MAPK激酶和泛素化相关基因，提示中后期防御需要持续的信号放大和蛋白质修饰调控。

3.3 WGCNA网络
16个共表达模块中，蓝色模块（7,326基因）和蓝绿色模块（9,443基因）与感染时间呈强正相关（r=0.60和0.57）。这些模块富含受体样蛋白激酶（RLKs）、钙离子结合蛋白（如GhCIPK6）和病程相关蛋白，其枢纽基因多参与钙信号传导和细胞壁重塑。

3.4 机器学习筛选
三算法共识筛选出15个核心基因，包括模式识别受体GhRLP6、钙调蛋白GhCBP60A、类黄酮合成酶GhF3'H等。网络分析显示这些基因与WRKY33、NAC11等转录因子形成紧密互作网络，共同调控"生物刺激响应"和"细胞壁生物合成"等通路。

3.5 实验验证
qRT-PCR证实GhRLP6在根系48 h表达量达对照的12倍（log₂FC=3.6），与RNA-seq结果高度一致（R2=0.83）。钙信号元件GhCIPK6和GhCBP60A同样呈现根系特异性诱导模式。

4 讨论
研究揭示陆地棉采用"时空分层防御"策略：根系通过GhRLP6等PRRs快速识别病原PAMPs，激活钙信号级联（GhCIPK6/GhCBP60A）和MAPK通路；中后期则通过WRKY转录因子协调次级代谢（如GhF3'H催化类黄酮合成）和细胞壁强化。该发现突破了传统抗病基因筛选模式，首次将机器学习应用于棉花抗病网络解析，为设计多基因叠加育种策略提供了理论依据。

5 结论
研究系统鉴定了GhRLP6-GhCIPK6-GhF3'H为核心的抗病调控轴，阐明其通过PTI-ETI协同、钙信号转导和代谢重构三层机制抵抗大丽轮枝菌。这些靶点为培育广谱持久抗病品种奠定了分子基础，对保障棉花产业可持续发展具有重要意义。