植物乳杆菌PO23表面展示鳗弧菌保护性抗原FlaB及其在牙鲆中的免疫应答研究

为解决鳗弧菌(Vibrio anguillarum)对水产养殖业的危害问题，研究人员利用高粘附性植物乳杆菌(L. plantarum)PO23构建表面展示FlaB抗原的活疫苗LP-PO23-1/LP-PO23-2。通过LysM/LPXTG锚定技术实现抗原表面展示，口服免疫后显著提升牙鲆(Paralichthys olivaceus)肠道酶活性及MHCII、TNFα等免疫基因表达，血清IgM抗体显著升高，为开发安全高效的口服疫苗提供新策略。

　　

水产养殖业长期面临鳗弧菌(Vibrio anguillarum)感染的严峻挑战，这种病原菌能引发多种鱼类的高死亡率，每年造成巨大经济损失。传统抗生素防治方式不仅导致药物残留和环境污染，更催生了耐药菌株的涌现。在此背景下，开发安全高效的疫苗成为行业迫切需求。值得注意的是，乳酸菌作为天然肠道共生菌，既能有效刺激粘膜免疫，又可作为抗原递送载体，在口服疫苗领域展现出独特优势。

山东省高校青年创新团队发展计划等项目支持下，研究人员选择从牙鲆肠道分离的高粘附性植物乳杆菌PO23(LP-PO23)作为载体，创新性地采用两种表面展示技术——基于转糖基酶基因lp_3014的LysM锚定域和基于细胞表面蛋白基因lp_2578的LPXTG基序，分别构建重组质粒pFLY(pMG36e-LysM-FlaB)和pFLP(pMG36e-FlaB-LPXTG)。通过电转化获得重组菌株LP-PO23-1和LP-PO23-2，采用SDS-PAGE、Western blotting验证蛋白表达，免疫荧光(IF)和免疫电镜(IEM)确认表面定位。以1×10⁹ cfu/g浓度制备口服疫苗，系统评估了其在牙鲆中的免疫效果。

主要技术方法包括：1) 基因重组构建含FlaB抗原的表达系统；2) 电转化技术获得重组乳酸菌；3) 免疫组化技术验证抗原定位；4) qPCR检测免疫基因表达；5) 酶活性分析评估免疫效果。实验用牙鲆来自山东烟台某养殖场。

研究结果：

1. 疫苗构建与表征：成功实现FlaB在乳酸菌表面的功能性展示，SDS-PAGE显示LysM-FlaB(约45 kDa)和FlaB-LPXTG(约43 kDa)条带，Western blotting证实其免疫原性，IF和IEM直观显示抗原定位于菌体表面。

2. 肠道定植能力：qPCR检测显示口服疫苗能有效定植肠道，其中LP-PO23-1定植效率显著高于LP-PO23-2(p<0.05)，为持续免疫刺激奠定基础。

3. 免疫激活效应：疫苗组肠道酸性磷酸酶(ACP)、碱性磷酸酶(AKP)和总超氧化物歧化酶(T-SOD)活性呈动态升高，第14天达到峰值，较对照组提升2-3倍(p<0.01)。

4. 免疫基因调控：口服免疫后MHCII、TNFα、IL-1β等免疫相关基因表达显著上调，其中LP-PO23-1组MHCII表达量在第21天达对照组的8.6倍(p<0.001)，显示强烈的粘膜免疫激活。

5. 体液免疫应答：血清特异性IgM抗体水平在免疫后第28天达到峰值，LP-PO23-1组抗体效价较对照组提高32倍(p<0.001)，证实系统免疫的有效激活。

结论与讨论表明，基于LysM锚定的LP-PO23-1展现出更优的免疫效果，其通过"粘膜-系统"免疫协同作用机制，既能激活肠道局部免疫应答，又能诱导全身性抗体产生。该研究不仅证实乳酸菌表面展示技术的可行性，更创新性地比较了不同锚定系统的效果差异，为开发抗鳗弧菌口服疫苗提供了重要理论依据。特别值得注意的是，该疫苗采用食品级乳酸菌为载体，完全避免了传统疫苗的佐剂使用，在安全性、便捷性和环境友好性方面具有显著优势，符合水产养殖业绿色发展的需求。研究成果发表于《Fish》期刊，对推动水产疫苗技术创新具有重要指导意义。