SARS-CoV-2刺突蛋白S659位点O-GlcNAc糖基化修饰增强病毒颗粒稳定性和包装效率的机制研究

本研究揭示了SARS-CoV-2刺突蛋白（S）在S659位点的O-连接β-N-乙酰葡糖胺（O-GlcNAc）修饰通过抑制泛素化降解途径显著增强蛋白稳定性，并首次证明该修饰对假病毒颗粒（SARS-CoV-2pp）包装效率的关键调控作用，为靶向糖基化通路的抗病毒策略提供新靶点。

　　

ABSTRACT
SARS-CoV-2刺突蛋白（S）的O-GlcNAc糖基化修饰是近期研究热点。通过免疫共沉淀（IP）和谷胱甘肽-S-转移酶（GST） pull-down实验，研究团队首次证实S蛋白与O-GlcNAc转移酶（OGT）存在物理相互作用。离子淌度质谱和点突变研究共同锁定S659为关键修饰位点，该位点在所有变异株中高度保守。

Interaction of S protein with OGT
在HEK293T细胞中，GFP标记的S蛋白与HA标记的OGT的互作实验显示，两者在细胞内形成稳定复合物。GST-OGT重组蛋白能特异性pull-down GFP-S，而GST对照组无此现象，证实了二者直接相互作用。

O-GlcNAcylation modification at S659
质谱检测到S659位点肽段（AGCLIGAEHVNNS*YECDIPIGAGICASYQTQTNSPR）存在+203.07 Da的质量偏移，与O-GlcNAc修饰理论值吻合。当使用OGA抑制剂Thiamet-G（TMG）增强修饰信号时，S659A突变体的RL2抗体检测信号降低80%，证明该位点修饰特异性。

Impact on protein stability
S659A突变导致S蛋白泛素化水平增加3倍，而过表达OGA（O-GlcNAc水解酶）进一步加剧此现象。环己酰亚胺（CHX）追踪实验显示，野生型S蛋白半衰期达12小时，而突变体仅维持6小时，揭示O-GlcNAcylation通过抑制泛素-蛋白酶体途径维持蛋白稳定性的新机制。

Viral entry and packaging
有趣的是，表面等离子共振（SPR）分析显示S659A突变不影响S蛋白与ACE2的结合亲和力。但在四质粒系统（pLenti6-Luc/pLP1/pLP2/GFP-S）构建的假病毒实验中，S659A突变使Huh7.5.1细胞的荧光素酶活性降低65%，提示该修饰主要影响病毒颗粒组装而非受体识别。

DISCUSSION
研究构建了OGT-S659-O-GlcNAcylation-泛素化降解轴的调控模型：OGT介导的修饰像"分子保护伞"般阻止E3泛素连接酶接近S蛋白，而OGA则充当"去保护"开关。这种精细调控可能解释为何S659在进化中高度保守——适度修饰水平既维持蛋白稳定性，又不妨碍构象变化所需的动态调节。

MATERIALS AND METHODS
实验采用HEK293T和Huh7.5.1细胞系，通过PEI MAX转染系统实现高效共转染。假病毒包装实验中，8:4:3:3的质粒比例（Luc:Gag/Pol:Rev:S）被证明能产生最高效价。所有Western blot数据均经Image J量化，统计学分析采用GraphPad Prism 8.0完成，显著性阈值设定为P<0.05。

该研究不仅阐明了S蛋白翻译后修饰的新机制，更启示了靶向OGT/OGA平衡的药物设计策略——通过小分子调节剂精确控制S蛋白的"糖衣盾牌"厚度，可能成为对抗COVID-19的新武器。