基于可诱导E/M蛋白表达的稳定细胞系生产SARS-CoV-2病毒样颗粒疫苗的研究

本研究针对SARS-CoV-2疫苗大规模生产的技术瓶颈，通过建立可诱导表达E/M蛋白的稳定细胞系，成功开发出高效制备病毒样颗粒(VLPs)的新平台。研究人员采用Tet-on系统调控毒性蛋白表达，构建双质粒共转染体系，实现了SARS-CoV-2 VLPs的规模化生产，并证实其可诱导小鼠产生特异性IgG抗体。该研究为应对新冠病毒变异及未来疫情提供了可快速响应的疫苗开发策略。

　　

在全球新冠疫情持续演变的背景下，疫苗开发面临两大核心挑战：一是现有疫苗对不断出现的病毒变异株保护效力下降；二是传统疫苗生产技术存在规模化瓶颈。病毒样颗粒(VLPs)因其具有天然病毒结构却不含遗传物质的特点，被视为理想的疫苗候选物，但常规的瞬时转染生产方式成本高、难以放大。更棘手的是，SARS-CoV-2的结构蛋白中，膜蛋白(M)和包膜蛋白(E)的持续高表达会引发细胞毒性，这成为建立稳定生产细胞系的主要障碍。

四川大学华西医院的研究团队在《BMC Biotechnology》发表的研究中，创新性地将Tet-on诱导系统应用于SARS-CoV-2 VLPs生产。他们首先通过密码子优化显著提高了四种结构蛋白(S、M、N、E)的表达效率，发现优化后的VLPs产量提升且能诱导小鼠产生S蛋白特异性抗体。为解决M/E蛋白的细胞毒性问题，研究人员设计了两套诱导型表达系统：pTetcoM-coN-BSD和pTetcoE-coS-Puro，其中M/E的表达严格受控于强力霉素诱导。通过双抗生素(嘌呤霉素和杀稻瘟素)共筛选，成功建立了可稳定生产VLPs的HEK293T细胞系。

关键技术方法包括：1)密码子优化和哺乳动物表达载体构建；2)Tet-on诱导系统的应用；3)双质粒共转染和稳定细胞系筛选；4)超速离心纯化VLPs；5)透射电镜(TEM)表征颗粒形态；6)小鼠免疫实验评估免疫原性。

研究结果部分显示：
"SARS-CoV-2 CoVLPs produced following transient transfection induced immune responses against wild-type SARS-CoV-2 antigens in mice"：密码子优化使VLPs产量显著提高，电镜显示颗粒直径约120nm，小鼠免疫实验证实其可诱导剂量依赖的S蛋白特异性IgG。

"Long-term overexpression of M and E proteins induced cytotoxicity"：发现M/E蛋白持续表达导致48小时内细胞死亡率达60-80%，而S/N蛋白无此毒性。

"Inducible expression of M and E proteins using a Tet-on system"：成功构建Tet-on调控系统，未诱导时细胞存活率>90%，诱导后M/E表达可控。

"Construction of multi-gene co-expression plasmids for the SARS-CoV-2 structural proteins"：开发的双表达载体(pTetcoM-coN-BSD和pTetcoE-coS-Puro)实现了四基因的协调表达。

"Establishment of stable cell lines for inducible expression of SARS-Cov-2 VLPs"：建立的稳定细胞系产量达3μg/7.4×10⁷细胞，电镜证实颗粒形态完整。

"Antibody responses to stable cell line-derived VLPs in mice"：稳定细胞系生产的VLPs可诱导小鼠产生S蛋白抗体，二次免疫后抗体滴度提升14.3倍。

该研究的突破性在于：首次将诱导型表达系统应用于冠状病毒VLPs生产，解决了毒性蛋白表达与细胞存活之间的矛盾。所建立的平台具有三大优势：1)可大规模扩增的稳定细胞系；2)精确调控的毒性蛋白表达；3)产品质量稳定。虽然诱导的中和抗体反应较弱，但通过剂量优化或佐剂改进有望增强免疫效果。这项技术不仅为SARS-CoV-2疫苗开发提供了新思路，其模块化设计更可快速适配其他变异株或新兴病原体，对应对未来疫情具有重要战略意义。