德氏乳杆菌保加利亚亚种VI104的代谢工程改造：通过途径优化构建高效D-乳酸细胞工厂

来自国内的研究人员针对德氏乳杆菌保加利亚亚种(L. bulgaricus)存在的半乳糖代谢缺陷、乳糖利用不全及遗传工具匮乏等问题，通过开发高效电转(~104 CFU μg-1 DNA)、pLEM415穿梭载体和PldhL强启动子等分子工具包，异源表达galK/galT恢复半乳糖利用，过表达pyk平衡ATP稳态，协同调控pfk/pgk/dldh提升糖酵解通量，最终获得耐受性提升3.4倍、D-乳酸产量达9.39 g L-1(光学纯度99.09%)的工程菌株，为乳酸菌精密调控提供了创新平台。

　　

德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus)作为同型发酵乳酸菌，不仅是乳品发酵的关键菌种，更是目前已知少数能天然合成光学纯D-乳酸(D-lactic acid, DLA)的微生物——这种高价值化合物正是聚乳酸生物塑料的核心单体。然而该菌的工业化应用长期受制于三大瓶颈：半乳糖代谢通路(galactose metabolism)缺陷、乳糖(lactose)利用率低下，以及遗传操作工具的匮乏。

科研团队以VI104菌株为研究对象，率先构建了包含高效电穿孔(效率达10⁴ CFU/μg DNA)、pLEM415穿梭载体和基于乳酸脱氢酶启动子(P_ldhL)的强表达系统在内的分子工具箱。通过引入外源半乳糖激酶(galK)和半乳糖转移酶(galT)基因修复了半乳糖利用缺陷，同时过表达丙酮酸激酶(pyk)重新平衡了细胞ATP稳态。为进一步提升代谢流，研究者采用组合策略共表达磷酸果糖激酶(pfk)、磷酸甘油酸激酶(pgk)及主要D-乳酸脱氢酶(dldh)亚型，使糖酵解途径(glycolytic pathway)通量得到显著增强。

最终获得的工程菌LdbVI104_07展现出令人瞩目的性能：在优化发酵条件(3%乳糖、0.15%谷氨酰胺与苯丙氨酸、40℃、pH 6.5)下，其酸耐受性提升3.4倍，DLA产量达到9.39 g/L，光学纯度高达99.09%，转化率达0.188 g/g底物。转录组分析揭示，核心代谢基因表达量提升2.5倍以上，而全局调控因子碳分解代谢阻遏蛋白(ccpA)则显著下调，从分子层面验证了代谢网络的重编程效果。

这项突破不仅将L. bulgaricus转化为可编程的工业级细胞工厂，更为乳酸菌的精准代谢调控提供了模块化策略，在可持续生物制造、治疗制剂开发及合成生物学领域具有广阔应用前景。