长程PCR结合纳米孔测序技术实现Fuchs角膜内皮营养不良TCF4三核苷酸重复扩增的高通量检测

本研究通过开发长程PCR与纳米孔测序相结合的新方法，解决了Fuchs角膜内皮营养不良(FECD)致病基因TCF4中CTG18.1三核苷酸重复扩增检测的技术瓶颈。研究人员在119例FECD患者中鉴定出73.1%携带≥50次重复的致病性扩增，发现SNP rs599550与扩增等位基因强连锁，为临床诊断和精准治疗提供了高效技术路径。

　　

在眼科遗传疾病领域，Fuchs角膜内皮营养不良(FECD)作为全球角膜移植的首要病因，其发病机制长期困扰着研究人员。这种进行性眼病以角膜内皮细胞进行性丢失为特征，导致角膜水肿和视力丧失，尤其影响30岁以上人群，女性发病率是男性的3倍。尽管已知转录因子4(TCF4)基因内含子2区的CTG18.1三核苷酸重复扩增是主要致病因素，但传统检测方法如Southern印迹需微克级DNA且通量低，短串联重复PCR(STR-PCR)仅能检测≤35次重复，严重制约了临床筛查和家系研究。

英国利兹大学圣詹姆斯医院研究所(University of Leeds, St James's University Hospital)的Bushra Alayed团队在《Molecular Diagnosis》发表的研究中，创新性地将长程PCR与牛津纳米孔技术(Oxford Nanopore Technologies)相结合，建立了只需纳克级DNA即可精确测定CTG18.1重复次数的检测体系。通过对119例FECD患者和83例对照的对比分析，不仅证实73.1%患者携带≥50次重复的致病性扩增，更发现SNP rs599550的G等位基因与扩增等位基因存在80.8%的强连锁，为群体遗传学研究提供了新靶点。

关键技术包括：1)设计跨CTG18.1位点的长程PCR引物，通过两轮扩增引入样本特异性条形码；2)使用Flongle流动池进行纳米孔测序，单次运行可平行分析10个样本；3)采用STRique算法从单分子水平精确计数CTG重复次数；4)通过四大家系分析揭示扩增等位基因的跨代表达不稳定现象。

比较STR/TP-PCR基因分型和长读长纳米孔测序

研究团队通过平行实验证实，纳米孔测序与常规STR/TP-PCR检测结果高度一致，但前者能精确测定传统方法无法分辨的大片段扩增。如图2所示，患者553的扩增等位基因被准确量化为93次重复，而传统方法仅能报告"阳性"。

FECD患者与对照组的重复次数比较

纳米孔测序揭示73.1%(87/119)FECD患者携带≥50次重复的致病性扩增，而对照组仅1.2%(1/83)。统计学分析显示携带扩增等位基因个体患病风险增加60倍(p<0.01)，印证了CTG18.1扩增与FECD的强因果关系。

CTG18.1位点的家族传递

对四个多发家系的追踪显示，扩增等位基因遵循显性遗传规律，但在传递过程中出现重复次数波动(图4)。特别值得注意的是，三名30岁以下无症状携带者的检出，为早期干预提供了时间窗。

CTG18.1位点的单倍型分析

研究发现rs599550 SNP的G等位基因在扩增单倍型中出现频率达80.8%，显著高于欧洲人群基线水平(14.6%)。该SNP距重复序列仅997bp，比既往研究的rs613872(40kb)更具临床标记价值。

这项研究的意义在于建立了首个可临床推广的FECD高通量筛查方案，其纳米孔测序技术将检测成本控制在每样本30英镑以内。发现的rs599550连锁现象为解释欧洲人群FECD高发提供了群体遗传学证据，而家系研究中观察到的重复不稳定性则暗示体细胞嵌合可能影响疾病外显率。这些发现不仅为FECD的分子诊断树立了新标准，也为靶向RNA毒性疗法的开发奠定了技术基础。