斑马鱼pfkma/pfkmb基因敲除揭示PFKM在糖代谢紊乱及能量代谢障碍中的调控机制

本研究针对糖尿病中磷酸果糖激酶肌肉型(PFKM)表达下降的临床现象，利用CRISPR/Cas9技术构建pfkma/pfkmb双敲除斑马鱼模型，发现突变体出现血糖升高、胰岛增殖、ATP减少及运动能力下降等现象，首次揭示PFKM通过调控糖代谢和线粒体功能(peo1/mfn1/drp1等基因)影响能量代谢的分子机制，为糖尿病治疗提供新靶点。

　　

糖尿病作为一种以持续高血糖为特征的代谢性疾病，其发病机制中胰岛素分泌缺陷与葡萄糖代谢异常的关系始终是研究热点。前期临床研究发现，糖尿病患者尿液外泌体中肌肉型磷酸果糖激酶(Phosphofructokinase, muscle, PFKM)表达显著降低，这个调控糖酵解限速步骤的关键酶可能成为连接糖代谢紊乱与能量代谢障碍的重要分子线索。然而，PFKM究竟如何参与糖尿病发生发展？其调控网络涉及哪些代谢通路？这些问题亟待解答。

北京世纪坛医院（Beijing Shijitan Hospital）的研究团队创新性地选择斑马鱼作为模式生物，利用其pfkma/pfkmb基因与人类PFKM的高度同源性，通过全胚胎原位杂交和CRISPR/Cas9基因编辑技术构建双敲除模型，结合qRT-PCR、ATP检测和行为学分析等多维度研究方法，系统揭示了PFKM在代谢调控中的核心作用。该研究成果发表于《General and Comparative Endocrinology》期刊，为理解糖尿病发病机制提供了新的理论依据。

关键技术方法包括：1）基于Daniocell和ZESTA数据库分析pfkma/pfkmb时空表达谱；2）CRISPR/Cas9构建pfkma/pfkmb双敲除斑马鱼；3）全胚胎葡萄糖检测和5日龄幼鱼胰岛形态观察；4）线粒体功能相关基因(peo1/mfn1/drp1/nd2/cytb/cox3/atp6)表达量检测；5）运动行为轨迹分析系统。

【Homology and expression profile of pfkma and pfkmb】
通过多序列比对发现斑马鱼pfkma(784aa)和pfkmb(899aa)与人类PFKM(780aa)具有高度保守性，特别是在ATP结合位点和变构调节区域。胚胎发育表达谱显示这两个基因从原肠期开始广泛表达，暗示其在早期能量供应中的基础作用。

【Knockout phenotypes】
双敲除胚胎呈现三大特征：1）全胚胎葡萄糖蓄积，证实PFKM缺失导致糖酵解流受阻；2）5日龄幼鱼胰岛β细胞异常增殖（Tg(NeuroD:EGFP;ins:mCherry)标记），提示代偿性胰岛素分泌增加；3）ATP水平下降38%伴运动能力减弱，与线粒体融合基因mfn1和分裂基因drp1表达失衡相关。

【Molecular mechanisms】
能量代谢相关检测显示：1）线粒体基因组nd2/cytb/cox3转录本减少；2）ATP合成酶亚基atp6表达下调；3）线粒体质量控制基因peo1（同源人类Twinkle基因）表达量降低45%，这些证据共同指向PFKM缺失引发的"糖酵解-线粒体轴"功能障碍。

该研究首次在脊椎动物模型中证实PFKM具有"代谢稳定器"的双重功能：既通过调控糖酵解速率维持血糖稳态，又通过peo1-mfn1-drp1通路影响线粒体动力学和氧化磷酸化效率。特别值得注意的是，pfkma/pfkmb双敲除引发的胰岛代偿性增生现象，为理解2型糖尿病中β细胞功能衰竭的渐进过程提供了新视角。从转化医学角度看，尿液外泌体PFKM含量可能成为糖尿病早期筛查的生物标志物，而针对PFKM活性的小分子调节剂开发或将成为代谢性疾病治疗的新策略。