噬菌体递送CRISPR相关转座酶实现靶向细菌基因组编辑

这篇研究通过工程化改造λ噬菌体，成功将CRISPR相关转座系统（DART）递送至目标细菌，实现了高效、精准的基因组编辑（效率>50%）。创新性结合Cas13a反选策略与同源重组技术，在单菌及混合菌群中完成基因敲除和大片段插入，为微生物组功能调控提供了可扩展工具。

　　

研究背景

微生物群落研究面临原位编辑技术瓶颈，现有方法如抗生素处理或益生菌引入存在特异性不足等问题。噬菌体因其天然宿主特异性成为理想递送载体，但传统CRISPR-Cas抗菌策略无法实现稳定遗传修饰。本研究突破性整合CRISPR相关转座系统（CAST）与噬菌体递送平台，通过λ噬菌体搭载DNA编辑全集成RNA引导CRISPR-Cas转座酶（DART），实现细菌染色体的靶向改造。

技术突破

团队首先构建温度敏感型λ噬菌体（cI857 Sam7突变体），利用Cas13a反选策略完成基因组大规模改造：

1. 精准编辑验证：通过同源重组实现7 bp微小修饰（如Sam7突变），并成功删除1.6-12.3 kb非必需区域（如Δlom-ea59）。
2. 大片段插入：将3.2 kb lacZ报告基因插入噬菌体基因组，证实载体容量。
3. DART系统整合：一次性替换12.3 kb区域（含attP位点以避免溶原化），嵌入10.8 kb DART系统（含gentR-sfGFP转座子），创建λ-DART噬菌体。

编辑机制

λ-DART感染宿主后，DART组分（TnsABC-TniQ-Cas876复合物）在CRISPR RNA引导下，将2.2 kb转座子精准整合至目标位点（如thyA或lacZ）。关键发现包括：

• 启动子强度影响：强启动子J23119使编辑效率提升至50%以上（MOI=100，48小时孵育）。
• 宿主表型：荧光显微镜显示编辑细胞呈现伸长形态，可能与λ蛋白表达相关。
• 群落编辑：在三菌属（大肠杆菌、类鼻疽伯克霍尔德菌、产酸克雷伯菌）混合体系中，仍实现0.01%的特异性编辑。

应用前景

该技术突破为微生物组研究提供两大优势：

1. 精准递送：利用噬菌体宿主特异性，避免传统共轭转移的种间限制。
2. 多功能编辑：DART系统支持 kilobase级片段插入（如代谢通路导入）与基因敲除同步完成。

技术细节

• Cas13a反选：通过靶向删除区域的转录本（如lom mRNA）富集编辑噬菌体。
• 双突变调控：cI857温度敏感突变与Sam7裂解缺陷突变协同控制感染动态。
• 脱靶控制：非溶原化设计（删除int-attP）防止载体基因组残留。

研究展望

未来可拓展至其他噬菌体-宿主系统，并通过工程化尾丝蛋白拓宽宿主范围。该平台为肠道菌群调控、环境微生物改造等应用奠定基础，但需进一步优化载体持久性与宿主适应性。