新型热网菌N-乙酰氨基葡萄糖2-差向异构酶催化乳果糖合成的创新途径

本研究针对化学法合成乳果糖存在反应条件苛刻、副产物分离困难等问题，通过在大肠杆菌中异源表达热网菌来源的N-乙酰氨基葡萄糖2-差向异构酶(DithAGE)，发现Sumo标签融合蛋白具有最高异构化活性。通过表面残基K182R突变获得催化效率提升的突变体，在85°C/90°C下乳果糖转化率分别达40.37%和35.19%，为酶法合成乳果糖提供了新策略。

　　

乳果糖作为一种具有益生元功能的双糖，在医药和功能性食品领域应用广泛。然而传统化学合成法需要强碱高温条件，不仅能耗高还会产生复杂副产物。虽然β-半乳糖苷酶和纤维二糖2-差向异构酶(CE)已被用于酶法合成，但前者需额外添加果糖增加成本，后者转化效率有限。更棘手的是，高温生产过程易导致微生物污染，而中温酶又面临底物溶解度低的困境。

研究人员注意到极端嗜热菌Dictyoglomus thermophilum的最适生长温度高达78°C，其基因组注释的N-乙酰氨基葡萄糖2-差向异构酶(AGE)可能具备优异的热稳定性。虽然已知AGE能催化N-乙酰氨基葡萄糖差向异构化，但能否像其同家族的CE一样催化乳糖异构化为乳果糖尚属未知。这项发表在《Bioresource Technology》的研究，通过基因工程手段首次实现了AGE介导的乳果糖高效合成。

研究采用pCold TF和pET-22b(+)两种大肠杆菌表达系统，结合Sumo等融合标签优化表达条件。通过定点突变改造表面残基提升酶学性质，采用HPLC监测乳果糖转化率。热稳定性通过残余酶活测定，使用圆二色谱分析蛋白结构变化。

【Plasmid selection for expressing recombinant DithAGE】
研究发现Sumo标签融合的DithAGE异构化活性最高，SDS-PAGE显示其分子量约55kDa与理论值相符。相比pET-22b(+)系统，pCold TF表达的可溶性蛋白占比提高32.6%，但Sumo-DithAGE比活达到6.07 U·mg^-1。

【Characterization of recombinant DithAGE】
酶学性质分析显示野生型在85°C半衰期达4.5小时，最适pH为7.5。值得注意的是，反应体系中几乎未检测到差向异构化产物表乳糖，表明DithAGE特异性催化乳糖C2位异构化。

【Improvement of DithAGE by site-directed mutagenesis】
基于表面电荷分析，将Lys182替换为精氨酸的K182R突变体在90°C处理5小时后残余活性达60.23%，较野生型提高44%。比活提升至6.84 U·mg^-1，动力学参数显示其k_cat/K_m值改善1.8倍。

【Lactulose synthesis by DithAGE and its mutant】
在8小时反应中，K182R在85°C和90°C下的乳果糖转化率分别达40.37%和35.19%，较野生型提升4.49-6.41个百分点。高温反应优势明显：85°C时底物溶解度达320g/L，是无菌操作的理想温度窗口。

该研究首次证实AGE超家族成员具有乳糖异构化功能，打破了仅CE能催化该反应的认知。构建的K182R突变体兼具高热稳定性(90°C半衰期延长至7.2小时)与高转化效率，为工业化生产提供了优质酶元件。采用微生物表达系统替代化学合成，符合绿色制造理念。未来通过理性设计进一步优化酶性能，或将推动功能性低聚糖生产的技术革新。