靶向剪接位点的CRISPR/Cas9基因敲除技术显著提升鱼类基因编辑效率与新种质创制

为解决鱼类基因编辑中移码突变效率低、表型外显率不足的问题，研究人员通过靶向剪接位点(SS)的CRISPR/Cas9技术，在罗非鱼tyrb、hps4等8个基因中实现高效mRNA错误剪接，使F0代无效突变率(NMR)提升至79.48%（hps5 I7 5'SS），表型率(PhR)提高7-30倍，为长生殖周期鱼类的基因功能研究和种质创新提供新策略。

　　

在基因编辑领域，CRISPR/Cas9技术虽已广泛应用于模式生物，但在具有长生殖周期的养殖鱼类中仍面临重大挑战——传统靶向编码区(CDS)的编辑策略因移码突变效率不足，导致F0代表型外显率低，而建立纯合突变系又需耗费数年时间。这一瓶颈严重制约了鱼类基因功能研究和育种应用。

西南大学的研究团队在《Aquaculture and Fisheries》发表的研究中，创新性地将CRISPR/Cas9的靶点转向基因剪接位点(SS)。通过设计靶向tyrb、hps4等8个基因内含子-外显子边界"GT-AG"保守序列的gRNA，结合胚胎显微注射、转录组测序和表型统计等方法，系统比较了SS与CDS靶向策略的编辑效率。研究发现：靶向SS的gRNA能在F0代实现79.48%的无效突变率(NMR)，较CDS靶向提升11倍；在tyrb基因中，53.8%的SS突变个体出现黑色素细胞缺失表型，其中29.48%呈现类似纯合突变的完全白化特征。机制上，任何破坏"GT-AG"四碱基的突变（如E2跳跃、I7保留）均可导致mRNA错误剪接。研究还首次绘制了DSB位点周围40bp的突变热图，确立"DSB距离SS≤4bp"的最优设计原则。

研究结果部分：

1. SS突变引发mRNA错误剪接
   通过tyrb I2 5'SS等靶点证实，SS突变导致E2外显子跳跃或I7内含子保留，错误剪接转录本经Sanger测序验证。

2. SS靶向显著提升编辑效率
   hps5 I7 5'SS突变体的NMR达79.48%，较CDS靶向提高11倍；78.4%个体出现黑色素异常，30.05%呈现纯合表型。

3. 边界四碱基的关键作用
   "GT-AG"任一碱基突变均可破坏剪接，如hps4 I5 3'SS的"AG→AA"即引发I6保留。

4. 多基因验证普适性
   在chrd等7个基因中，SS靶向平均使NMR提升36%，chrd I5 5'SS突变体的无眼表型率达49.38%。

该研究突破性地证明，SS靶向策略通过强制mRNA错误剪接，能规避传统CDS编辑的移码突变随机性问题。对于性成熟周期长达4-9年的养殖鱼类（如鲟鱼、草鱼），该技术可缩短纯合系建立时间，加速重要性状基因解析。研究提出的"四碱基破坏"机制和gRNA设计规范，为lncRNA等非编码基因编辑提供新思路，被评价为"鱼类精准育种领域的里程碑式进展"。