基于时间分辨荧光技术的侧流免疫层析法开发：实现中东呼吸综合征的快速高敏诊断

本研究针对中东呼吸综合征(MERS)缺乏快速诊断方法的临床痛点，开发了基于时间分辨荧光(TRF)技术的侧流免疫层析检测法(LFIA)。研究人员通过制备MERS-CoV核衣壳蛋白(N蛋白)特异性单克隆抗体，构建Europium纳米颗粒标记的TRF-LFIA系统，实现了0.1 ng/ml的检测限和5×104 copies/ml的病毒灵敏度，较传统方法提升25倍，为MERS的现场快速诊断提供了创新解决方案。

　　

中东呼吸综合征(MERS)作为由冠状病毒引发的烈性呼吸道传染病，自2012年首次暴发以来已造成36%的高死亡率，被世界卫生组织列为最高公共卫生风险疾病。尽管新冠疫情的非药物干预措施意外抑制了MERS传播，但病毒在骆驼宿主中的持续存在仍构成潜在威胁。当前诊断完全依赖需要专业设备的qRT-PCR技术，开发即时、灵敏的现场检测工具成为防控的关键突破口。

韩国基础科学研究院(Korea Basic Science Institute)的研究团队创新性地将时间分辨荧光技术引入诊断领域。针对MERS-CoV高度保守的N蛋白，研究人员通过分段免疫策略获得特异性单抗，利用Europium纳米颗粒的长荧光寿命特性，结合生物素-链霉亲和素定向固定技术，构建出突破传统LFIA灵敏度限制的新型检测平台。该成果发表于《Scientific Reports》，为呼吸道传染病诊断树立了新标杆。

关键技术包括：1) 分段表达MERS-CoV N蛋白NTD和CTD结构域制备免疫原；2) 杂交瘤技术筛选高亲和力单克隆抗体；3) 生物层干涉仪(BLI)定量抗体亲和力；4) Europium纳米颗粒标记抗体构建TRF探针；5) 病毒培养和热灭活处理建立检测标准。临床样本采用鼻咽拭子模拟物验证。

【抗原制备和mAb生产】
通过原核表达系统分别制备N端(NTD)和C端(CTD)结构域，免疫小鼠后获得6株单抗。间接ELISA验证显示N6E6、N7E9、N8F7和C6D2对MERS-CoV N蛋白具有纳摩尔级亲和力(KD=0.001-1.589 nM)，且不与SARS-CoV等交叉反应。

【抗体配对筛选】
直接夹心ELISA从36种组合中优选N6E6-C6D2等三对NTD/CTD靶向抗体，其检测限达2.5 ng/ml。纤维素纳米珠(CNB)-LFIA验证显示，N6E6-C6D2对在传统平台上已实现优于商业抗体的性能。

【TRF-LFIA构建】
创新性设计包含生物素垫的三明治结构：生物素化捕获抗体通过链霉亲和素定向固定，Europium标记检测抗体形成"时间门控"信号系统。该设计使N6E6-C6D2对的灵敏度提升至0.1 ng/ml，较CNB-LFIA提高25倍。

【病毒检测验证】
对培养的MERS-CoV检测限达5×10⁴ copies/ml，在模拟鼻咽样本中保持5×10⁵ copies/ml的检出能力。所有测试均未出现与SARS-CoV-2等病原体的交叉反应。

该研究突破了传统LFIA在灵敏度与特异性的技术瓶颈，其创新点主要体现在三个方面：首先，结构域分段免疫策略成功获得非竞争性抗体对；其次，TRF技术通过毫秒级荧光寿命有效抑制背景噪声；最后，生物素-链霉亲和素系统优化了抗体固定效率。这种将稀土元素荧光特性与免疫层析技术融合的方案，不仅为MERS防控提供了首个可靠的POCT工具，其技术框架更可拓展至其他新发传染病的诊断系统开发。随着后续临床验证的推进，这项兼具科研创新性和公共卫生价值的研究，有望重塑呼吸道传染病现场检测的技术格局。