发根农杆菌介导的樱草遗传转化及转基因发状根全植株再生技术建立

本研究首次建立发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes）介导的樱草（Primula sieboldii）遗传转化体系，通过发状根（hairy root）诱导和体细胞胚胎发生（somatic embryogenesis）实现全植株再生。该技术突破传统转化效率低（5%）的局限，利用RUBY可视化报告系统（含CYP76AD/DODA/GT基因）实现转化事件快速筛选，并通过全基因组测序验证T-DNA稳定整合。研究为解析樱草自交不亲和（self-incompatibility）和花柱异型（heterostyly）的S位点超级基因（S-locus supergene）提供工具，同时为药用皂苷（sakurasosaponin）代谢工程奠定基础。

　　

引言

樱草属（Primula）作为早春观赏植物，其物种P. sieboldii兼具园艺价值和药理活性，但长期缺乏稳定遗传转化体系。该研究针对其特有的花柱异型（由S位点超级基因调控CYP734A50/GLO2等基因）和抗癌皂苷（sakurasosaponin）合成需求，开发了基于发根农杆菌A4菌株（含RiA4质粒）的双阶段转化系统。

材料与方法

培养体系：采用MS培养基（含0.1 mg/L GA₃）启动种子萌发，通过高浓度NAA（2 mg/L）诱导根段形成胚性愈伤组织。细菌制备：电穿孔法将35S:RUBY载体（含hpt抗性基因）转入A4菌株，OD₆₀₀=0.1的菌液用于侵染。关键步骤：预培养20天的根段经共培养后，在含timentin（350 mg/L）的激素游离MS20培养基中诱导发状根，6周后筛选红色转化根（RUBY报告基因激活酪氨酸-甜菜红素通路）。

结果

转化效率：5%的外植体产生红色发状根（22/420），体细胞胚胎发生率达100%（10-100个胚胎/外植体）。分子验证：PCR确认rolB（Ri质粒TL-DNA）与DODA（35S:RUBY）共整合；RNA-seq显示CYP76AD/DODA/GT在叶片高表达（TPM>10⁴）；全基因组测序揭示TG3系存在单拷贝T-DNA插入。表型分析：转基因植株保持正常花形态（L/S型），T1代符合孟德尔分离比（55%红色幼苗），证实生殖系稳定遗传。

讨论

该体系突破传统农杆菌（A. tumefaciens）转化效率低的瓶颈，其优势在于：①发状根单细胞起源避免嵌合体；②体细胞胚胎发生途径实现高效再生；③RUBY系统实现无抗性筛选。未来可应用于：①解析CYP734A50调控花柱长度的机制；②代谢工程改造皂苷合成通路；③创制自交亲和新品种。值得注意的是，转化植株未出现典型rol基因相关表型（如节间缩短），可能与TL-DNA表达量相关。

应用前景

建立的发状根培养体系可直接用于规模化生产抗肿瘤皂苷（如通过生物反应器扩增），而全植株再生技术为Primula属功能基因组研究提供通用平台，尤其适用于研究自交不亲和相关的GABA受体调控网络及抗流感病毒活性成分开发。