基于甘油一锅法RAA/CRISPR-Cas12a技术的铜绿假单胞菌快速检测新策略

本研究创新性地开发了甘油一锅法重组酶辅助扩增（RAA）结合CRISPR-Cas12a的检测体系，通过物理隔离实现扩增与检测的同步进行，显著降低气溶胶污染风险。该方法针对铜绿假单胞菌（PA）特异性lasB基因，灵敏度达1.20×10?4 ng/μL（荧光法），临床验证显示100%灵敏度与特异性，为院内感染防控提供了快速（<45分钟）、便携的双模式（荧光/侧流层析）检测方案。

　　

1 引言

铜绿假单胞菌（PA）作为革兰阴性条件致病菌，其多重耐药性和环境适应力导致院内感染高发。传统培养法耗时48-72小时，qPCR依赖精密仪器，亟需开发快速精准的检测技术。近年来，等温扩增技术（如RAA、RPA）与CRISPR-Cas12a的联用成为研究热点，但传统两步法存在气溶胶污染风险，而常规一锅法因Cas12a提前激活导致效率降低。本研究创新性引入甘油作为物理屏障，构建单管封闭式检测体系。

2 材料与方法

2.1 试剂与菌株
采用ATCC标准菌株（PA 27853等）及64例临床分离株，通过VITEK^?2系统鉴定。核心试剂包括RAA扩增基础试剂盒、LbCas12a酶及荧光报告探针（5′-FAM-TTATT-BHQ1-3′）。

2.3 RAA原理
重组酶-引物复合物识别靶DNA后，在单链结合蛋白（SSB）辅助下完成链置换，DNA聚合酶以37°C恒温实现指数扩增。

2.4 CRISPR-Cas12a切割机制
crRNA引导Cas12a特异性结合lasB基因后，激活其反式切割活性，无差别降解ssDNA报告分子释放荧光信号。

2.8 甘油一锅法构建
体系分为A（含10%甘油的CRISPR组分）和B（RAA组分）两部分。扩增15分钟后离心混匀，Cas12a反应30分钟。侧流层析（LFS）采用FAM-生物素双标记探针，通过金标抗体显色判读。

3 结果

3.1 体系优化
10%甘油浓度可平衡隔离效果与反应效率（P<0.001）。最佳条件为：37°C RAA扩增15分钟（引物200 nM），Cas12a/crRNA浓度均为200 nM。

3.2 灵敏度与特异性
荧光检测限达1.20×10^?4 ng/μL，LFS法为1.20×10^?3 ng/μL。对15种非靶标菌株（如肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球菌）均无交叉反应。

3.5 临床验证
64例样本（45例PA阳性）检测结果与PCR完全一致，热图分析与紫外/蓝光显色均显示100%符合率。

4 讨论

相较于光控crRNA（成本高）和微流控（设计复杂）方案，甘油一锅法以低廉试剂实现近似两步法的效率。虽需核酸提取预处理，但总耗时（75分钟）仍显著短于培养法。未来可开发直接样本检测方案，拓展至呼吸道分泌物等复杂基质。

5 结论

该技术为PA感染提供了一种兼具操作简便性（单管封闭）、多模式读值（荧光/LFS）和超高灵敏度的现场检测工具，尤其适合基层医疗机构应用。