基于磷蛋白基因的实时荧光定量PCR检测技术实现小反刍兽疫病毒全谱系精准诊断

本研究建立了一种基于PPRV磷蛋白（P）基因的TaqMan实时荧光定量RT-PCR（RT-qPCR）检测方法，可同步检测I-IV谱系小反刍兽疫病毒（PPRV）。该方法灵敏度达4拷贝/μL（II-IV谱系），对田间样本检测与标准方法符合率100%，较N基因方法显著提升弱阳性样本检出率，为全球PPR eradication计划提供新型分子诊断工具。

　　

引言

小反刍兽疫（PPR）是由小反刍兽疫病毒（PPRV）引起的高度接触性传染病，主要感染山羊、绵羊等小反刍动物。该病毒根据核衣壳（N）基因或融合（F）基因差异分为四个谱系：I、II谱系主要分布于非洲，III谱系见于非洲和阿拉伯半岛，而IV谱系呈现全球性流行态势。世界动物卫生组织（WOAH）已将其列为2030年全球根除目标。

中国自2007年西藏首次报告疫情后，2013年新疆再现疫情并迅速扩散。尽管通过扑杀、强制免疫等措施已有效控制流行，但实验室诊断仍是防控关键。现有检测方法中，病毒分离耗时长达2周，血清学检测在疫苗免疫区适用性有限，而基于N基因的RT-qPCR方法对II谱系敏感性不足。

材料与方法

研究团队通过比对GenBank中PPRV全基因组序列，在P基因保守区设计引物和TaqMan探针：正向引物5′-GAYTCCGAGTATGAGTATGAGGATG-3′，反向引物5′-GCTATCATTATACTGGAMAGATGGCC-3′，探针FAM-CGTGCAAGCATTGCYAARATCCATGA-BHQ1。使用中国动物卫生与流行病学中心提供的I-IV谱系标准毒株及合成质粒，在生物安全三级实验室进行RNA提取，采用Bio-Rad PCR仪进行一步法RT-qPCR检测。

灵敏度测试采用10倍梯度稀释的质粒（4-4×10⁵拷贝/μL），特异性测试涵盖山羊痘病毒（GPV）、口疮病毒（ORFV）等对照。重复性测试计算批内批间变异系数，并与前期建立的N基因方法进行40份田间样本平行检测对比。

结果

多序列比对显示设计引物与探针能覆盖全球主要流行毒株P基因保守区。灵敏度测试表明该方法对II-IV谱系检测下限达4拷贝/μL（I谱系为40拷贝/μL），标准曲线R²>0.99。特异性验证中仅PPRV毒株/质粒产生阳性信号，与GPV等病原无交叉反应。

重复性分析显示所有谱系变异系数<1.5%（IV谱系<1%）。田间样本检测与常规RT-PCR结果100%吻合，32份阳性样本全部检出。方法学比较发现新方法对94%弱阳性样本（Ct值>30）的检测灵敏度优于N基因法，3份N基因法漏检样本被成功检出。

讨论

当前IV谱系已成为全球优势流行株，而本研究建立的P基因检测法对流行毒株展现卓越性能：

1. 广谱性：同步覆盖所有谱系，弥补N基因法对II谱系敏感性不足的缺陷
2. 灵敏性：较RT-RPA等新技术（检测限14.98拷贝/μL）提升3倍以上
3. 实用性：批处理成本仅为新型等温扩增技术的1/5

值得注意的是，虽然对I谱系灵敏度相对较低，但该谱系已十年无流行报告。研究团队建议将该方法纳入WOAH诊断标准，并与国际实验室合作开展多毒株验证，进一步推动全球PPR根除计划。未来研究将聚焦于冻干试剂开发，以提升该方法在资源匮乏地区的适用性。