单细胞多组学测序技术CRAFTseq精准解析CRISPR编辑疾病变异的分子效应

本研究针对非编码疾病变异功能解析的瓶颈问题，开发了CRAFTseq多组学单细胞测序技术，通过同步捕获基因组DNA编辑、转录组和表面蛋白表达数据，在原发性人类T细胞中成功鉴定了IL2RA自身免疫变异rs61839660的状态依赖性效应，并揭示了PTPRC基因敲除导致的CD4补偿性上调机制。该研究为复杂疾病变异的精准功能解析提供了创新工具。

　　

基因组学研究已鉴定数千个与非编码区域相关的疾病变异位点，但确定这些变异的具体功能仍是当前研究的重大挑战。传统方法面临编辑效率低、细胞异质性高以及培养条件干扰等多重限制，难以准确捕捉单个核苷酸变异带来的微妙调控变化。特别是在免疫细胞中，许多自身免疫疾病相关变异表现出复杂的细胞状态依赖性效应，亟需开发能够同时获取基因型与多维度表型数据的新技术。

哈佛大学医学院的研究团队在《Nature》发表的研究中，开发了名为CRAFTseq（CRISPR by ADT, flow cytometry and transcriptome sequencing）的革命性技术平台。这项四模态单细胞检测方法可同步获取：1）靶向基因组DNA扩增子测序数据；2）全长转录组数据；3）154种表面蛋白的抗体衍生标签（ADT）；4）基于流式细胞术的细胞哈希信息。研究人员将该技术应用于多种基因编辑场景，包括基因敲除、调控区缺失、非编码单核苷酸多态性（SNP）等位基因和多重编辑，成功在原发性人类T细胞中揭示了IL2RA基因rs61839660变异在调节性T细胞（T_reg）增殖状态下的特异性激活效应，并首次发现蛋白酪氨酸磷酸酶受体C型（PTPRC/CD45）敲除导致CD4分子补偿性上调的分子机制。

关键技术方法包括：1）改良的FLASH-seq全长RNA测序协议；2）巢式PCR扩增特定基因组区域；3）基于流式分选的细胞哈希技术；4）单细胞水平CRISPR编辑效率的定量分析；5）多模态数据整合的统计建模。研究使用来自健康志愿者的原代CD4⁺ T细胞和多种人类细胞系（Jurkat、Daudi、HEK293T）进行实验验证。

【A robust multimodal single-cell approach】
研究人员首先在混合细胞系（Jurkat、Daudi、HEK293T）中验证了CRAFTseq技术的可靠性。通过PTEN基因座的特异性扩增，在单细胞水平准确识别了Jurkat细胞中已知的7bp插入和38bp插入突变，错误率低于1.5%。多组学数据整合分析显示，RNA测序平均每个细胞检测到5,089±71个基因，与10x Genomics平台性能相当，而表面蛋白标记物的聚类结果与流式细胞术分型高度一致（R=0.59）。

【Identifying genotype-dependent outcomes】
在HLA-DQB1调控区编辑实验中，研究人员观察到删除片段大小与HLA-DQB1表达水平呈显著正相关（ANOVA，P<10^-8），且该效应具有高度基因特异性。而在FBXO11基因编辑实验中，单细胞基因型分析揭示了CD40L刺激反应的剂量依赖性抑制，包括FBXO11、IGLL1和CD40的下调（FDR<0.05），这些效应在传统条件对照分析中被非特异性培养效应所掩盖。

【Knockout in primary human CD4 T cells】
通过对原代CD4⁺ T细胞中PTPRC基因的碱基编辑，研究发现提前终止密码子（ESC）导致PTPRC转录本减少（P<10^-16），并引发36种表面蛋白的显著改变。值得注意的是，CD4蛋白表达出现1.5倍上调（P=0.017），流式验证实验证实这是对CD45缺失的补偿性调节。基因集富集分析（GSEA）显示这些变化与T辅助1型细胞（T_H1）激活通路密切相关。

【Defining the RPL8 eQTL causal allele】
针对B细胞特异性表达数量性状位点（eQTL）rs2954658的编辑实验证实，该变异对RPL8基因表达具有特异性调控作用（0.9倍变化，P<10⁹），且不影响其他基因表达。与批量RNA测序相比，CRAFTseq能更灵敏地检测这种细微的顺式调控效应。

【IL2RA cell-state-dependent effects】
在IL2RA基因rs61839660（与1型糖尿病、哮喘和类风湿关节炎相关）的研究中，研究人员发现该风险等位基因（T）仅在增殖状态的T_reg细胞中显著增加IL2RA表达（1.19倍，P=0.00016），而在T_H1极化细胞中无显著影响，揭示了该变异的细胞状态依赖性调控特性。

【Highly multiplexed editing in PAX5】
通过PAX5基因两个DNA结合域（NTD和CTD）的多重编辑，研究发现B.29（p.I135T）突变对113个下游基因产生广泛影响，包括VPREB3和JCHAIN的相反调控。值得注意的是，A区域编辑与B.29基因评分存在显著协同效应（LRT，P<0.0001），表明PAX5不同结构域在基因调控中具有复杂相互作用。

这项研究通过创新的CRAFTseq技术平台，实现了对非编码疾病变异功能效应的精准解析。与现有方法相比，该技术具有三大突破性优势：1）单细胞水平直接鉴定编辑基因型，避免sgRNA代理分析的偏差；2）多模态数据同步获取，可区分真实的基因型效应与培养环境干扰；3）适用于原