E3泛素连接酶RFFL内源性底物JMJD6与DNAJB11的定量蛋白质组学鉴定及其在脂质代谢中的新功能

本研究针对蛋白质质量控制失衡导致疾病发生的核心问题，通过CRISPR/Cas9基因编辑构建RFFL敲除/回补细胞模型，结合非标记定量质谱技术系统鉴定E3连接酶RFFL的作用靶点。研究人员首次证实组蛋白去甲基化酶JMJD6和内质网伴侣蛋白DNAJB11是RFFL通过泛素-蛋白酶体途径降解的内源性底物，并意外发现RFFL参与脂质代谢调控，为靶向蛋白质降解治疗策略提供新靶点。

　　

在细胞这个精密运转的"蛋白质工厂"中，泛素-蛋白酶体系统(UPS)如同质量监督员，通过给错误折叠或功能异常的蛋白质贴上泛素"标签"(ubiquitination)，引导它们进入蛋白酶体(proteasome)这个"粉碎机"。其中E3泛素连接酶作为特异性识别底物的关键分子，其功能紊乱与多种疾病密切相关。然而，目前对RING型E3连接酶RFFL(又称RNF189L)的生理底物认知仍存在巨大空白，这种认知缺失严重阻碍了针对蛋白质降解异常相关疾病的治疗开发。

研究人员通过构建RFFL基因敲除(KO)、回补(rescue)和野生型(WT)三组同源细胞系，采用非标记定量质谱(label-free quantitative mass spectrometry)技术开展互作组(interactome)和差异表达分析。实验设计创新性地引入正交验证策略：首先通过CRISPR/Cas9技术构建RFFL-KO细胞系消除背景干扰，再通过稳定转染RFFL cDNA构建回补细胞系作为阳性对照。这种"缺失-恢复"的闭环研究模式显著提高了底物鉴定的可靠性。

在技术方法层面，研究主要运用：1）基因编辑技术构建同源细胞模型；2）非标记定量质谱进行全局蛋白质组分析；3）免疫共沉淀验证蛋白质相互作用；4）环己酰亚胺追踪实验检测蛋白质半衰期；5）泛素化修饰检测体系。

研究结果揭示：

1. 底物筛选系统建立：通过比较三组细胞系的蛋白质组差异，建立RFFL潜在底物筛选标准——在KO细胞中积累且在回补细胞中恢复降解的蛋白质。
2. JMJD6的降解机制：组蛋白去甲基化酶JMJD6在RFFL-KO细胞中显著积累，回补RFFL后其水平恢复正常。体内实验证实RFFL通过K48连接的多聚泛素链修饰JMJD6，促使其经蛋白酶体降解。
3. DNAJB11的调控途径：内质网应激伴侣蛋白DNAJB11被鉴定为RFFL新底物，其降解依赖RFFL的E3连接酶活性，敲除RFFL导致DNAJB11半衰期延长3.2倍。
4. 脂质代谢意外发现：蛋白质组数据意外显示RFFL缺失引起脂质代谢相关通路显著改变，提示该E3连接酶可能通过降解未知底物参与脂质调控。

这项发表于《Journal of Proteome Research》的研究具有三重突破意义：首先，首次建立RFFL内源性底物的系统鉴定方法，为研究其他E3连接酶提供范式；其次，发现JMJD6和DNAJB11这两个具有重要生理功能的蛋白质受RFFL调控，拓展了对蛋白质质量控制网络的认知；最后，揭示RFFL可能参与脂质代谢调控的全新生物学功能，为代谢性疾病研究开辟新视角。这些发现不仅为囊性纤维化等蛋白质折叠异常疾病提供潜在治疗靶点，也为开发靶向RFFL的蛋白质降解药物奠定理论基础。