CRISPR-Cas9构建载脂蛋白B（apoB）缺陷型肝癌Huh-7细胞模型揭示脂蛋白分泌调控新机制

为解决高胆固醇血症治疗中apoB靶向干预的机制空白，研究人员通过CRISPR-Cas9技术构建了apoB缺陷型人肝癌Huh-7细胞（Ako细胞），发现其保留了完整的脂蛋白组装分泌机制但丧失apoB分泌能力。该模型揭示了apoB缺失会上调维生素D结合蛋白（VDBP）和凝血/补体通路，为理解脂蛋白代谢与DNA复制、免疫调控的交叉作用提供了新视角，相关成果发表于《Journal of Lipid Research》。

　　

高胆固醇血症是心血管疾病的重要诱因，而载脂蛋白B（apoB）作为脂蛋白颗粒的核心结构蛋白，是降低血浆胆固醇的关键靶点。然而，apoB基因缺陷如何系统性影响细胞功能尚不明确。由于apoB基因敲除小鼠存在胚胎致死性问题，且患者样本难以获取，开发可靠的体外模型成为迫切需求。

针对这一挑战，国外研究团队通过CRISPR-Cas9基因编辑技术，在人类肝癌Huh-7细胞中成功构建了apoB缺陷型细胞系（Ako细胞）。研究发现，这些细胞虽完全丧失apoB分泌能力，但微体甘油三酯转移蛋白（MTP）的表达和活性未受影响。当转入apoB48表达质粒时，Ako细胞能正常分泌apoB48脂蛋白，证实其脂蛋白组装机制完整。令人意外的是，转录组和分泌蛋白组分析显示，apoB缺陷显著上调了维生素D结合蛋白（VDBP）和凝血/补体通路相关基因，同时激活了DNA复制通路，而内质网应激标志物和细胞增殖未受影响。

研究主要采用CRISPR-Cas9基因编辑构建稳定敲除细胞系，通过ELISA和Western blot验证蛋白表达，结合FPLC分析脂蛋白分泌谱，并运用RNA-seq和质谱技术进行多组学分析。

APOB基因敲除导致人肝癌细胞apoB分泌缺失
通过三组sgRNA靶向apoB基因第六外显子，获得6个克隆均显示apoB mRNA降低70%，细胞内及培养基中apoB100蛋白完全消失（图1）。

MTP活性不受apoB缺失影响
MTP的mRNA水平、蛋白表达及甘油三酯（TG）/磷脂（PL）转移活性在Ako细胞中均保持正常（图2），表明脂质转移功能独立于apoB存在。

转基因apoB48可被正常分泌
转入apoB48质粒后，Ako细胞分泌的脂蛋白经FPLC验证为LDL尺寸颗粒（图3），证实脂蛋白组装机制完整。

脂质蓄积与内质网应激未加剧
油红O染色和TG定量显示apoB缺陷未引起脂质堆积（图4），ATF4、XBP1等内质网应激标志物表达也无显著变化。

多组学揭示通路重编程
转录组发现DNA复制（如MCM复合体）和凝血/补体通路（如SERPING1、C1s）上调（图5-6），而分泌蛋白组中VDBP成为最显著上调蛋白（图8）。

该研究不仅建立了首个可逆向回补的apoB缺陷型肝癌细胞模型，更揭示了apoB在调控凝血、免疫和基因组稳定性中的非经典功能。这些发现为理解低apoB血症患者的凝血异常和维生素D代谢紊乱提供了分子基础，也为开发靶向apoB的降脂疗法提供了安全性评估的新维度。研究同时提示，apoB与MTP缺陷虽均阻断脂蛋白分泌，但可能通过不同机制影响细胞通路，这一发现为后续比较研究指明了方向。论文数据已上传至GEO数据库（编号GSE269949），为领域内进一步探索提供了重要资源。