利用患者特异性类器官预测FAP患者结直肠癌风险：APC基因突变的结构功能解析与CRISPR修复策略

本研究针对家族性腺瘤性息肉病(FAP)患者携带APC基因种系突变导致结直肠癌(CRC)高风险的问题，通过CRISPR/Cas9基因编辑技术修复FAP来源的人胚胎干细胞(hESC)突变，结合AlphaFold2蛋白结构预测和类器官模型，揭示了不同APC突变类型通过盐桥介导的显性负效应机制。研究发现FAP1/2突变体通过异常异源二聚体破坏β-catenin降解复合体功能，而FAP3因蛋白截短程度较轻仍可形成正常结肠类器官，为FAP的精准分型和治疗靶点开发提供了新思路。

　　

结直肠癌(CRC)作为全球高发恶性肿瘤，其发生发展与APC基因突变密切相关。在家族性腺瘤性息肉病(FAP)患者中，APC种系突变导致结肠腺瘤的早期发生，若不干预将100%进展为CRC。尽管已知APC是Wnt/β-catenin通路的"守门人"，但不同突变位点如何影响疾病严重程度仍不清楚。尤其令人困惑的是，某些APC突变患者临床表现轻微，而另一些则呈现爆发性息肉生长，这种基因型-表型关联的分子机制亟待解析。

以色列特拉维夫Sourasky医学中心(Tel Aviv Sourasky Medical Center, TASMC)的研究团队在《Cancer Gene Therapy》发表的研究中，利用独特的FAP患者来源人胚胎干细胞(hESC)模型，结合前沿的基因编辑和计算生物学技术，首次从蛋白质结构层面阐明了APC突变异质性的分子基础。研究人员选取三种携带不同APC突变的FAP-hESC系（FAP1：p.Arg332^*；FAP2：655aa截短体；FAP3：85aa截短体），通过CRISPR/Cas9修复突变后成功恢复了结肠类器官形成能力。借助AlphaFold2预测发现，FAP1/2突变体通过形成18个异常盐桥的稳定异源二聚体，以显性负效应(dominant-negative)方式破坏全长APC功能，而FAP3因仅保留N端寡聚化结构域且盐桥数量少(5个)，仍可维持正常β-catenin降解复合体功能。

关键技术方法包括：1) 基于CRISPR/Cas9-PX459系统的APC突变修复（设计含沉默突变的供体质粒避免重复切割）；2) 多能性标志物(SSEA4/TRA-1-60/EpCAM)流式验证；3) 三维结肠类器官分化体系（CHIR99021/activin A诱导肠系分化）；4) AlphaFold2预测蛋白二聚化界面及盐桥相互作用；5) 免疫组化分析结肠标志物CDX2与间质标志物vimentin表达。

CRISPR基因编辑成功修复APC突变
通过设计靶向FAP1(c.994C>T)和FAP2(c.1958+1G>A)突变位点的gRNA，结合含沉默突变的供体质粒，分别获得8%和1.5%的修复效率。RFLP和Sanger测序验证显示，修复后的克隆恢复了正常APC序列，且保持>95%的多能性（图1）。

突变修复挽救结肠类器官表型
修复后的FAP1/2-hESC成功分化为表达CDX2的复杂结肠类器官（每滴Matrigel形成>5个类器官），而未修复组仅形成1-2个囊状结构（图3A-B）。免疫组化显示修复组CDX2表达量与正常对照组相当，间质标志物vimentin显著降低（图3C-D），证实APC突变是类器官发育障碍的主因。

APC突变体的结构功能解析
AlphaFold2建模显示：1) 全长APC通过N端1-57aa形成同源二聚体，含6个盐桥；2) FAP3(85aa)通过保守的Glu74-Arg187等5个盐桥形成功能性二聚体；3) FAP1/2则因额外产生Arg187-Asp183等盐桥（总数达18个），形成异常稳定的异源二聚体（图6D）。这种"分子胶"效应解释了FAP1/2突变体对全长APC的显性抑制作用。

该研究首次将CRISPR修复、类器官模型与AI蛋白质预测相结合，揭示了APC突变通过空间位阻效应破坏β-catenin降解复合体的新机制。特别重要的是，发现盐桥数量而非单纯截短长度决定突变严重程度，为FAP的精准分型提供了分子标志物。此外，研究鉴定的异常盐桥界面可作为小分子抑制剂靶点，为开发"分子胶"阻断疗法奠定基础。这些发现不仅推进了对CRC起始机制的理解，也为遗传性肿瘤的个性化干预提供了新范式。