基于RPA-CRISPR/Cas12b的一管式一步法检测平台在沙门氏菌高效检测中的应用研究

针对传统沙门氏菌检测方法耗时长、操作复杂的问题，研究人员开发了整合重组酶聚合酶扩增(RPA)与CRISPR/Cas12b系统的一管式一步法检测平台。该技术可在1小时内实现60拷贝/测试的检测限(LOD)，对19.5 CFU/ml的污染样本仍能准确检出，与培养法结果100%一致，为食源性病原体监测提供了快速精准的新工具。

　　

沙门氏菌作为全球最重要的食源性病原体之一，每年导致超过1.53亿例胃肠炎和5.7万例死亡，在中国更占据细菌性食物中毒事件的70%-80%。传统培养法需耗时4-5天，PCR技术虽缩短至1.5小时但仍依赖精密仪器。面对资源有限地区的检测需求，亟需开发更快速、精准且设备简化的检测方法。

扬州大学的研究团队在《Journal of Agriculture and Food Research》发表研究，创新性地将重组酶聚合酶扩增(RPA)与CRISPR/Cas12b系统整合，建立了"一管式一步法"检测平台。该技术突破传统两步法操作模式，通过优化sgRNA设计、Cas12b浓度(250 nM)和反应温度(42°C)，选用8T-FQ荧光报告系统，实现了在单管中同步完成核酸扩增与检测的全流程。

研究采用7对RPA引物筛选，最终选定SAL-1引物扩增高度保守的invA基因。通过检测36株沙门氏菌和20株非沙门氏菌参考菌株，验证了100%的特异性。灵敏度测试显示其检测限(LOD)达60拷贝/测试，在人工污染牛奶样本中可检出19.5 CFU/ml的沙门氏菌。实际检测306份禽类样本时，与培养法结果完全一致，其中鸡肉(28.42%)、鸭肉(47.50%)、鹅肉(45.16%)和鸽肉(19.23%)的阳性率与培养法100%吻合。

关键技术包括：(1)基于invA基因设计RPA引物和sgRNA；(2)优化一管式反应体系；(3)建立42°C恒温检测方案；(4)采用江苏扬州5个农贸市场采集的禽类样本进行验证；(5)通过荧光信号分析实现结果判读。

研究结果部分显示：
3.1 平台原理与流程：整个检测可在1小时内完成，包括15分钟DNA提取和45分钟CRISPR反应。
3.2 RPA引物筛选：SAL-1引物扩增效率最高，产物亮度显著优于其他引物。
3.3 条件优化：sgRNA-1介导的Cas12b活性最强，8T-FQ报告基团信号差异最显著。
3.4 灵敏度与特异性：Probit回归分析确定LOD为60拷贝，且能区分所有沙门氏菌血清型。
3.5 实际样本验证：在复杂基质牛奶中保持与纯核酸样本相当的灵敏度。
3.6 禽类样本检测：与培养法相比显著缩短检测时间，且避免交叉污染风险。

该研究突破性地解决了传统方法中核酸转移步骤导致的污染问题，将CRISPR检测的"超特异性"与RPA的"等温扩增"优势有机结合。相较于qPCR、LAMP等技术，其灵敏度提高10²-10⁴倍，且操作更简便。作者指出，未来可通过冻干试剂开发及免疫层析试纸条联用，进一步推动该技术在基层现场的普及应用，为食品安全监测体系提供新的技术支撑。