综述：利用CRISPR技术在安全港位点和内源基因构建人类报告细胞系的现代方法

这篇综述系统阐述了如何运用CRISPR/Cas9基因编辑技术，在基因组安全港（Safe Harbor）位点和内源基因中精准构建报告基因系统（如荧光蛋白/luciferase），相比传统非靶向整合方法可显著降低对邻近基因的干扰。文章重点探讨了报告细胞系在信号通路激活剂/抑制剂筛选中的关键作用，以及通过CRISPR实现位点特异性整合的技术优势，为开发新型治疗方案提供标准化研究工具。

　　

Abstract部分解析

报告系统在现代分子生物学中日益重要，其通过稳定表达荧光蛋白或荧光素酶（luciferase）等标记基因，为细胞水平和活体（in cellulo/in vivo）实验提供可视化检测手段。传统随机整合方法可能导致邻近基因表达异常，而CRISPR/Cas9介导的靶向整合——特别是定位在安全港位点时——能最大限度维持基因组稳定性。

关键技术突破

安全港位点筛选

研究证实人类基因组中ROSA26、AAVS1等位点适合外源基因整合。通过全基因组测序和转录组分析验证，这些区域具备以下特征：

• 远离致癌基因和必需基因

• 具有开放染色质结构

• 支持报告基因长期稳定表达

内源基因标记策略

利用同源定向修复（HDR）将报告基因插入目标基因位点：

1. 荧光蛋白标签与靶基因共表达

2. 信号肽序列确保蛋白正确定位

3. 通过2A自剪切肽实现多基因协同表达

应用前景

此类工程化细胞系已成功应用于：

• NF-κB、Wnt等关键信号通路研究

• 高通量药物筛选平台构建

• 肿瘤免疫治疗靶点验证

未来发展方向包括开发新型双报告系统、优化CRISPR递送效率，以及建立更全面的安全港位点数据库。值得注意的是，基于CRISPR的位点特异性整合技术正在推动报告细胞系成为标准化研究工具，其应用范围已从基础研究延伸至临床前试验领域。