奶酪成熟真菌Penicillium roqueforti中铁载体coprogen生物合成的分子机制解析

本研究针对蓝纹奶酪成熟关键真菌Penicillium roqueforti在铁限制环境下的生存机制，通过CRISPR-Cas9基因编辑和LC/HRMS技术，首次鉴定了由copA、copB、copE等基因组成的cop BGC（生物合成基因簇）负责铁载体coprogen的合成。研究揭示了该途径中关键酶的功能分工及中间产物（如coprogen B和dimerumic acid）的铁螯合活性，为理解真菌铁代谢适应机制提供了新视角，对食品微生物学和合成生物学领域具有重要价值。

　　

在蓝纹奶酪的成熟过程中，Penicillium roqueforti扮演着至关重要的角色，但奶酪环境却是一个典型的铁限制生态系统——铁浓度仅2-10 ppm，远低于微生物生长所需。这种极端环境迫使真菌进化出高效的铁获取策略，其中分泌铁载体（siderophore）是最主要的生存手段。尽管早在上世纪70年代就发现P. roqueforti能产生羟基肟酸型铁载体coprogen，但半个世纪以来，其生物合成的分子机制始终是未解之谜。

智利圣地亚哥大学（Universidad de Santiago de Chile）的研究团队通过基因组挖掘，在P. roqueforti CECT 2905菌株中锁定了一个20.4 kb的cop BGC，包含7个基因。为验证其功能，研究人员采用CRISPR-Cas9技术精准敲除三个核心基因（编码NRPS的copA、编码酰基转移酶的copB和copE），结合高分辨质谱分析突变体的代谢谱，首次绘制出完整的coprogen合成路线：CopB催化N⁵-羟基鸟氨酸与无水甲羟戊酰-CoA缩合形成AMHO；CopA作为非核糖体肽合成酶将AMHO单元组装成中间体coprogen B；最终由CopE完成乙酰化生成coprogen。

关键技术包括：1）基于antiSMASH的基因组挖掘确定BGC边界；2）CHOP-CHOP设计的CRISPR-Cas9靶向基因编辑；3）铁限制培养条件下的表型分析；4）LC/HRMS代谢组学检测铁载体及其衍生物。

分子机制解析

通过LC/HRMS检测，野生型菌株在保留时间3.72分钟处显示m/z 822.3138的coprogen-Fe³⁺特征峰，而突变体完全缺失该峰。copE-30突变体积累前体coprogen B（m/z 727.3884），证实CopE负责终产物的乙酰化修饰。值得注意的是，copB-12突变体仍能检测到AMHO（m/z 261.1459），暗示存在由fusarinine途径衍生的替代合成路线。

生理功能验证

CAS平板实验显示，copA和copB突变体的铁螯合指数（4.31→1.95-2.70）和菌落直径（2.16→1.67 cm）显著降低，而copE突变体因保留coprogen B和dimerumic acid的铁载体活性，生长几乎不受影响。这一梯度表型完美印证了"中间产物功能补偿"假说。

这项研究首次阐明P. roqueforti适应铁限制环境的分子武器库：1）核心途径中copB-copA-copE的级联反应实现coprogen高效合成；2）旁路途径通过fusarinine系统提供AMHO补给；3）降解产物dimerumic acid形成次级铁螯合防线。该发现不仅破解了奶酪微生物生态的关键谜题，其揭示的模块化合成策略更为设计新型铁载体提供了基因元件库。鉴于铁载体在病原真菌毒力中的重要作用，这些基因靶点还可能成为抗真菌药物开发的新方向。