印度天芥菜根部利用与地上部分相同的同型亚精胺氧化酶合成简单吡咯里西啶生物碱

这篇研究揭示了印度天芥菜（Heliotropium indicum）根部通过同型亚精胺氧化酶（HSO）催化合成简单吡咯里西啶生物碱（PAs）的机制，与地上部分复杂PAs的生物合成共享同一酶学途径。通过CRISPR/Cas9基因编辑和示踪实验，研究证实了铜胺氧化酶（CuAO）家族成员HiCuAO1在根部PA合成中的关键作用，揭示了Boraginales目植物PA代谢的进化保守性与组织特异性调控差异，为植物次生代谢多样性提供了新见解。

　　

Abstract
印度天芥菜（Heliotropium indicum）的根部能够利用与地上部分相同的同型亚精胺氧化酶（HSO）合成简单吡咯里西啶生物碱（PAs）。研究通过毛状根培养和¹³C标记示踪实验，发现根部主要积累未酯化的吡咯里西啶骨架（如trachelanthamidine），而复杂PA酯仅短暂存在。基因表达分析显示，HiCuAO2和HiCuAO3在根部高表达，但CRISPR/Cas9编辑证实仅HiCuAO1参与PA合成。系统发育和基因结构比较表明，Boraginales目植物的PA特异性CuAOs具有共同进化起源，但印度天芥菜与聚合草（Symphytum officinale）的PA代谢调控存在显著差异。

INTRODUCTION
植物次生代谢产物如吡咯里西啶生物碱（PAs）是重要的防御化合物，其合成常局限于特定组织。印度天芥菜的地上部分已知通过表皮细胞合成复杂PAs，而根部PA合成潜力尚未明确。本研究结合分子生物学与代谢分析，揭示了根部PA合成的酶学基础与进化背景。

MATERIAL AND METHODS
通过毛状根培养系统进行¹³C标记的腐胺（Put）和同型亚精胺（Hspd）示踪实验，结合GC-MS检测代谢产物。利用RT-qPCR分析HiHSS及5种HiCuAOs的转录水平。通过CRISPR/Cas9构建靶向hicuao1/3/5的编辑载体，转化毛状根后分析突变体代谢表型。

RESULTS

1. 根部特异性合成简单PAs
   毛状根培养显示，8周时检测到微量复杂PAs（可能来自初始组织残留），20周后仅存trachelanthamidine和其异构体isoretronecanol。示踪实验证实根部能将¹³C-Hspd转化为trachelanthamidine，但效率低于地上部分，并积累单环中间体N-(4-氨基丁基)吡咯烷。

2. HiCuAO1的功能特异性
   尽管HiCuAO3和HiCuAO5在体外能催化Hspd氧化生成双环吡咯里西啶骨架，但基因编辑表明仅HiCuAO1缺失会导致根部PA完全缺失并伴随Hspd积累（1355 nmol g^-1 FW），而hicuao3/5敲除株系表型正常。

3. 进化与结构保守性
   系统发育分析将HiCuAO1/3/5与聚合草的PA特异性CuAOs（SoCuAO1/5）归为Clade I，其基因结构均含4-5个外显子，且预测存在分泌途径信号肽。相比之下，HiCuAO2/4属于Clade III/II，无PA合成活性。

DISCUSSION
印度天芥菜根部PA合成途径的低效性为解析中间代谢提供了独特窗口。与聚合草不同，其仅依赖HiCuAO1而非旁系同源基因完成Hspd氧化，提示亚细胞区室化或转运机制可能限制冗余酶的底物接触。研究揭示了Boraginales目植物PA通路的共同进化起源，但不同物种通过基因复制与功能分化实现了组织特异性调控的多样性。

CONCLUSION
该研究阐明了印度天芥菜根部简单PA合成的分子基础，揭示了PA代谢在Boraginales目中的进化保守性与物种特异性调控模式，为植物次生代谢的时空协调机制提供了新认知。