群体感应调控的I型CRISPRi工具包实现代谢流动态重编程以增强维生素B5和B2的生物合成

本研究通过整合优化的群体感应(QS)系统与简化版I型CRISPR干扰(CRISPRi)技术，开发了可动态调控代谢流的QICi工具包。浙江大学团队在枯草芽孢杆菌中实现了对三羧酸循环关键基因citZ和孢子形成调控基因spo0A的精准时空调控，使D-泛酸(DPA)产量在5升发酵罐中达到14.97 g/L，核黄素(RF)产量提升2.49倍。该研究为微生物细胞工厂的智能调控提供了新型通用工具。

　　

在微生物代谢工程领域，如何实现代谢通路的动态精准调控一直是重大挑战。传统化学诱导系统成本高昂，而静态基因调控无法响应细胞生理状态变化。虽然群体感应(QS)系统和CRISPR干扰(CRISPRi)技术各自展现出调控潜力，但将两者整合创建自主响应式动态调控工具的研究仍属空白。特别是广泛使用的II型CRISPR-Cas9系统存在细胞毒性问题，而更温和的I型CRISPR系统又面临操作复杂的瓶颈。

针对这些关键问题，浙江工业大学生物工程学院的研究人员开发了群体感应控制的I型CRISPR干扰(QICi)工具包。这项发表于《Nucleic Acids Research》的研究，通过优化PhrQ-RapQ-ComA群体感应回路与简化crRNA载体构建方法，创建了能根据细胞密度自主调节的基因表达控制系统。研究团队不仅证明了该工具在枯草芽孢杆菌中的高效性，更通过动态调控中心代谢节点，显著提升了两种重要维生素的工业产量。

研究采用的主要技术包括：(1)通过启动子工程优化QS系统组分表达水平；(2)开发crRNA载体的"一步法"构建策略；(3)利用RT-qPCR验证基因动态抑制效果；(4)5升规模补料分批发酵评估工业适用性；(5)高效液相色谱(HPLC)和分光光度法测定产物浓度。

表征和设计QS系统基础的I型CRISPRi电路1.0(QICi 1.0)
研究人员首先将PhrQ-RapQ-ComA QS系统与I型CRISPRi整合，构建了初始版本的QICi 1.0。通过绿色荧光蛋白报告系统证实，QS启动子P_srfAA的活性随细胞密度增加而增强，但早期抑制效果较弱。这一现象揭示了单纯依赖QS调控crRNA表达的局限性。

通过截短重复序列简化I型CRISPRi系统设计
创新性地将crRNA的5'端重复序列截短13 bp、3'端截短4 bp后，发现抑制效果与全长序列相当。基于此开发的"一步法"载体构建策略，将构建时间从6天缩短至3天，显著提高了操作效率。热力学稳定性分析表明，crRNA的ΔG值与抑制效率呈负相关。

构建优化的QICi 2.0电路实现动态转录调控
通过调节rapQ和phrQ的表达强度组合，创建了四种强化版QS系统(Q1-Q4)。其中Q3系统(rapQ由P_43UTR12驱动、phrQ由P_hag驱动)表现出最佳的动态响应特性。比较发现，用QS系统调控Cascade表达(PSCAQ3)比调控crRNA(PCSAQ3)能产生更显著的早期抑制效果。

枯草芽孢杆菌DPA生产的代谢工程
在前期工作基础上，研究团队通过多策略优化DPA生产：(1)增加panBCD和ilvD基因拷贝强化前体供应；(2)敲除yitJ并过表达folD提升辅因子5,10-亚甲基四氢叶酸(5,10-CH₂-THF)水平；(3)删除abrB、skfA和lytC抑制孢子形成和细胞裂解。静态改造使DPA产量达到1.22 g/L。

利用QICi 2.0工具包动态下调孢子形成或TCA循环提升DPA滴度
动态抑制spo0A使DPA产量提高至1.55 g/L，孢子形成减少46.2%。RT-qPCR显示spo0A转录在12h和24h分别降低1.4倍和4.12倍。针对TCA循环关键酶citZ的动态调控中，QS-CRISPRi组合使转录水平在发酵后期降低3.09倍。5升发酵罐中，工程菌株ZPQ1-2的DPA产量达到14.97 g/L，创下枯草芽孢杆菌中不添加β-丙氨酸(β-ALA)的最高记录。

使用QICi 2.0工具包优化RF生产
通过将rib操纵子启动子替换为P_43UTR12并增加其拷贝数，使RF产量提升54%。动态抑制ribC(编码RF激酶/FMN腺苷酰转移酶)和pfkA(编码6-磷酸果糖激酶)分别使产量增加26.9%和2.49倍，而抑制purR(嘌呤操纵子阻遏物)则无显著效果，揭示了前体分流效应的存在。

这项研究的意义在于创建了具有自主知识产权的QICi动态调控平台，解决了I型CRISPR系统操作复杂和II型系统毒性高的双重难题。通过模块化设计，该工具可灵活应用于不同微生物宿主和代谢途径的优化。在产业化方面，14.97 g/L的DPA产量证明了其在规模化生产中的实用价值，为维生素等高附加值产品的绿色制造提供了新思路。特别值得注意的是，该研究首次实现了I型CRISPR系统与群体感应的有机整合，为合成生物学工具开发开辟了新方向。