一种用于基因组编辑和异源酶分泌的单向量CRISPR/Cas9系统在酿酒酵母中的应用：以果胶酶去除咖啡果胶为例

《Biotechnology Letters》：A single-vector CRISPR/Cas9 system for genome editing and heterologous enzyme secretion in Saccharomyces cerevisiae: a case study on pectate lyase for coffee mucilage removal

CRISPR/Cas9系统用于酿酒酵母基因编辑，通过单向量构建实现高效编辑（70-100%效率），整合枯草芽孢杆菌的分泌型果胶酶基因，工程菌株分泌的酶能有效降解咖啡豆表面果胶，降低粘性并提升色泽纯度。

　　

摘要

CRISPR/Cas9系统能够实现对多种生物体基因组的精确编辑。在本研究中，开发了一种适用于酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的单载体CRISPR/Cas9系统，该系统使用了来自化脓性链球菌（Streptococcus pyogenes）的II型Cas9酶以及一个针对第五染色体上CAN1.Y位点的单导向RNA盒。由于该系统采用了G418筛选方法，因此无需依赖营养缺陷标记物，从而能够广泛应用于不同酵母菌株。实验表明CRISPR/Cas9系统的编辑效率在70%到100%之间。该系统被用于将来自枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）168菌株的分泌型果胶酶（PL）基因整合到酵母基因组中。经过改造的酿酒酵母菌株能够分泌具有果胶降解活性的PL酶，这种酶显著降低了果胶残留量并增加了还原糖的产量。由于果胶是咖啡果胶的主要成分，因此将这种酶应用于咖啡豆中以去除果胶。处理后的咖啡豆果胶残留量显著减少，颜色变得更纯绿，黏度也有所下降。这些结果表明，这种改造后的酿酒酵母菌株在咖啡加工领域具有广泛应用潜力，尤其是在高效去除果胶方面。