综述：基于CRISPR的一站式核酸检测技术革新

这篇综述系统阐述了CRISPR/Cas系统从基因编辑工具到核酸检测平台的转型，重点介绍了一站式（one-pot）检测策略如何整合等温扩增（INA）与CRISPR信号生成，通过单管反应实现高灵敏度、特异性检测。文章剖析了Cas12/Cas13的转切割（trans-cleavage）特性及其在病原体诊断、食品安全等领域的应用潜力，同时指出反应动力学优化、多重检测等未来发展方向。

　　

CRISPR-based one-pot detection: A game-changer in nucleic acid analysis

Abstract
CRISPR/Cas系统从基因编辑工具发展为核酸检测平台，其高特异性、可编程性及trans-cleavage活性推动了检测技术革新。传统CRISPR检测需分步进行扩增与识别，而一站式策略将靶标扩增与Cas介导的信号生成整合于单管反应，显著减少操作步骤、降低污染风险，并提升对低丰度核酸的检测灵敏度与多重检测能力。

Introduction
核酸检测作为遗传信息载体，在疾病诊断（如病原体检测）、食品安全（如污染物识别）等领域至关重要。尽管PCR仍是金标准，但其耗时、高成本等局限催生了等温扩增技术（如LAMP、RPA）。CRISPR系统的发现（1987年Ishino报道，2002年命名）为分子诊断带来新机遇——Class 2的Cas9、Cas12a/Cas13a等蛋白通过RNA引导的靶向切割及trans-cleavage活性（如Cas12a切割ssDNA，Cas13a切割RNA），可构建高灵敏度检测平台。早期CRISPR检测需扩增与CRISPR分步进行，而SHERLOCK、DETECTR等技术的出现证明单温度反应的可行性。

CRISPR-powered amplification strategies for one-pot detection
当前一站式检测策略通过以下方式优化：

1. 时序控制：延迟CRISPR组分添加或温度阶段激活，避免扩增干扰；
2. 空间分隔：微流控芯片分隔扩增与检测区，通过毛细作用触发反应；
3. 试剂工程：改造Cas蛋白（如热稳定性突变体）或使用冻干试剂提升稳定性。
   典型案例包括：

• 结合RPA与Cas12a的SARS-CoV-2检测，灵敏度达10 copies/μL；
• 多重检测中，通过crRNA设计区分HPV亚型。

Challenges and outlooks
技术瓶颈包括：

• 预激活问题：扩增阶段Cas蛋白非特异性切割；
• 同步效率：扩增与检测反应动力学不匹配；
• 应用扩展：非核酸靶标（如蛋白质）检测体系仍需优化。
  未来方向聚焦：
• 开发新型Cas效应蛋白（如VII型）；
• 结合人工智能（AI）信号解析；
• 降低成本以适配资源有限地区。

Conclusions
一站式CRISPR检测通过整合INA与CRISPR的優勢，为床旁检测（POCT）提供革新方案。其在病原体监测、肿瘤标志物筛查等场景的应用潜力已获验证，但需进一步解决标准化、自动化等挑战以实现临床转化。

CRediT authorship contribution statement
通讯作者Zhixian Gao与Shuli Man主导课题设计，Xinyue Li等完成文稿撰写。

Declaration of competing interest
作者声明无利益冲突。

Acknowledgments
资助来自中国国家自然科学基金（32372415）、天津市科技计划（25JCLMJC00050）等。