基于生物信息学与CRISPR检测的RNA病毒抗病毒crRNA靶点高效筛选平台开发

本研究针对RNA病毒突变快、传统CRISPR靶点筛选耗时长的难题，创新性地结合CaSilico生物信息学分析与CRISPR-Cas13a体外检测技术，建立了高效抗病毒crRNA筛选平台。研究人员成功筛选出靶向SARS-CoV-2 N基因和登革病毒E基因的高效crRNA，在HEK293T和Vero细胞中分别实现84.55%和92.13%的病毒抑制率。该平台将筛选周期从传统细胞实验的数周缩短至数天，为RNA病毒快速防治提供了新策略。

　　

RNA病毒如同自然界中的"变形大师"，通过快速突变和重组不断逃逸人类免疫系统的追捕。从席卷全球的SARS-CoV-2到周期性爆发的登革病毒(DENV)，这些微小病原体给公共卫生安全带来持续挑战。更棘手的是，传统疫苗研发需要12-18个月，当疫苗问世时，病毒可能早已变异出新的亚型。在这场与病毒进化的赛跑中，军事医学科学院病原微生物生物安全国家重点实验室的研究人员将目光投向了CRISPR基因编辑技术。

CRISPR-Cas系统因其强大的可编程性被视为最有前景的抗病毒工具，但传统细胞筛选方法耗时费力。为解决这一瓶颈问题，研究团队创新性地将CaSilico生物信息学分析与CRISPR体外检测技术相结合，开发出抗RNA病毒crRNA靶点快速筛选平台。相关成果发表在《Molecular Therapy Nucleic Acids》期刊。

研究采用三大关键技术：1）基于CaSilico软件批量设计crRNA并筛选GC含量≥40%、U Rich>0.25、PAS>0.5的候选序列；2）建立CRISPR-Cas13a荧光核酸检测体系，通过荧光信号强度预测靶点切割效率；3）构建SARS-CoV-2 N基因-GFP报告系统和DENV感染模型，在HEK293T和Vero细胞中验证抗病毒效果。

研究结果部分：

1. CRISPR抗病毒靶点筛选方法的建立
   通过分析3'PFS位点和poly-4C结构对Cas13a活性的影响，确定最佳crRNA筛选标准。发现含连续4个C的crRNA会显著降低Cas13a切割效率（p<0.001），而3'PFS位点碱基类型不影响活性。

1. SARS-CoV-2靶点筛选平台的验证
   从24个N基因靶向crRNA中筛选出12个荧光信号>10,000 RFU的候选者。其中crRNA2和crRNA3在HEK293T细胞中对N-GFP报告基因的抑制率分别达84.55%和80.57%，且荧光信号与抑制率呈对数相关（R²=0.3286）。

1. DENV有效抗病毒靶点的筛选
   从10,696个潜在靶点中筛选75个候选crRNA，其中E-2330 crRNA对DENV-2的抑制率最高达92.13%。荧光信号与病毒抑制率的相关性分析显示，E基因区域R²=0.5687，显著高于NS1和NS5基因区域。

1. 最佳抗病毒条件的优化
   确定crRNA:Cas13a蛋白最佳转染比例为1:2（125 ng:500 ng），该条件下病毒滴度降低>1.5 log₁₀。时序实验显示抑制效果可持续4天，72小时达峰值（92.35%）。

1. 广谱抗病毒效果验证
   E-2330 crRNA对四种DENV血清型均有效，其中对DENV-1抑制最显著（病毒载量从2×10⁵ copies/mL降至10 copies/mL）。在HepG2细胞中也保持高效抑制（>90%）。

这项研究通过创新性的技术融合，将抗病毒CRISPR靶点筛选时间从传统方法的数周缩短至数天。建立的筛选平台具有三大突破：1）首次实现生物信息学预测与体外检测的闭环验证；2）发现荧光信号>10,000 RFU可预测>50%的细胞内抑制率；3）鉴定出对四种DENV血清型均有效的广谱靶点E-2330。特别值得注意的是，虽然靶向序列与DENV-4存在9个碱基错配，E-2330 crRNA仍保持显著抑制效果，这为应对病毒逃逸突变提供了新思路。随着呼吸道递送技术的发展，该平台筛选的CRISPR系统有望成为应对RNA病毒大流行的"基因疫苗"。未来可进一步拓展至Cas12、Cas13d等更多CRISPR系统，并整合保守性分析算法，为新发突发传染病的防控提供更强大的技术储备。