基于CRISPR/Cas9核糖核蛋白与体细胞核移植技术的无外源DNA整合型MSTN基因敲除犊牛培育

本研究通过CRISPR/Cas9 RNP（核糖核蛋白）与SCNT（体细胞核移植）技术结合，成功培育出无外源DNA整合风险的MSTN（肌肉生长抑制素）基因敲除犊牛。研究筛选出高效gRNA2（编辑效率96%），在牛胎儿成纤维细胞（BFF）和间充质干细胞（MSC）中实现靶向编辑，最终获得杂合子犊牛及二代克隆个体，为畜牧育种和生物医学研究提供了安全高效的技术范式。

　　

肌肉生长抑制素（Myostatin, MSTN）作为调控骨骼肌发育的关键因子，其功能缺失会导致动物出现"双肌"表型，显著提升产肉性能。传统育种手段需耗时数代才能实现的目标，如今通过基因编辑技术可在一代内完成。然而，现有方法如ZFN（锌指核酸酶）和TALEN（转录激活样效应因子核酸酶）存在效率低、成本高的问题，而CRISPR/Cas9系统虽高效但可能引发外源DNA整合风险。更棘手的是，受精卵显微注射产生的嵌合体问题，以及体细胞核移植（SCNT）技术固有的低出生率（仅1-5%），都制约着基因编辑牲畜的推广应用。

Kheiron Biotech S.A的研究团队在《Reproductive Biology》发表的研究中，创新性地采用CRISPR/Cas9核糖核蛋白（RNP）复合体替代传统质粒系统，结合SCNT技术，成功培育出无外源DNA整合的MSTN基因敲除犊牛。研究通过生物信息学预测编辑（BPE）筛选出靶向MSTN外显子2的高效gRNA2（效率96%），在牛胎儿成纤维细胞（BFF-E1）和获奖牲畜来源的间充质干细胞（MSC-E2）中实现高效编辑，最终通过胚胎移植获得健康犊牛。

关键技术包括：1）比较四种gRNA在质粒系统中的编辑效率；2）采用CAS9蛋白与tracrRNA/crRNA复合体进行无外源DNA编辑；3）利用SCNT技术构建胚胎；4）对屠宰场获取的牛胎儿细胞及优质牲畜MSC细胞进行基因编辑。

【Evaluation of different gRNAs to induce MSTN-KO】
通过质粒系统测试发现，靶向MSTN外显子2的gRNA2在BFF-E1细胞中实现96%编辑效率，显著高于其他gRNA（6-15%）。测序证实SCNT胚胎存在双等位基因编辑。

【Exogenous DNA-free gene editing】
改用RNP系统后，BFF-E2-male^ed和MSC细胞的BPE达31-59%，SCNT胚胎中提升至64-73.3%。移植35个MSC-E2-fem^ed胚胎后，成功获得杂合子MSTN敲除犊牛，并通过成纤维细胞供体培育出二代克隆个体。

该研究建立了兼顾安全性与高效性的基因编辑体系：1）RNP系统完全规避外源DNA整合风险；2）SCNT技术有效避免嵌合体产生；3）MSC细胞编辑后仍保持分化潜能。这不仅为畜牧育种提供了"精准育种"新策略，其无外源DNA整合特性更为生物医药领域（如人类疾病模型构建）提供了技术参考。研究证实，优质牲畜来源的MSC细胞经基因编辑后仍能支持胚胎发育，这为珍稀种质资源保存与利用开辟了新途径。