工程化糖基转移酶改造为特异性糖结合蛋白：一种新型唾液酸化核心2 O-糖链检测工具的研发

本研究针对传统凝集素(lectins)结合特异性差、抗糖抗体难以制备的难题，创新性地通过理性设计和哺乳动物细胞表面展示平台，将猪源ST3Gal1糖基转移酶改造为特异性识别唾液酸化核心2 O-糖链(Neu5Acα2-3Galβ1-3[GlcNAc(β1-6)]GalNAcα)的糖结合蛋白(GBP)。获得的sCore2突变体在血液细胞和组织微阵列分析中展现出独特的结合模式，为糖组学研究提供了新工具。该成果发表于《Nature Communications》，为糖基转移酶工程化应用开辟了新途径。

　　

糖链修饰是生命活动中至关重要的翻译后修饰，参与细胞识别、信号传导等关键生物学过程。然而，解析复杂糖链结构面临巨大挑战：传统凝集素结合特异性低，难以区分结构相似的糖链；而糖链免疫原性弱，又使得抗糖抗体制备异常困难。这些限制严重阻碍了糖生物学研究和糖链标志物的临床应用。

针对这一瓶颈问题，美国纽约州立大学布法罗分校(University at Buffalo, State University of New York)的研究团队独辟蹊径，提出将糖基转移酶(GTs)改造为糖结合蛋白(GBPs)的创新思路。研究人员选择猪源ST3Gal1(pST3Gal1)为研究对象，通过理性设计引入H302A突变使其丧失酶活但保留糖链结合能力，并开发新型哺乳动物表面展示平台筛选获得结合性能更优的sCore2突变体(H302A/A312I/F313S)。该成果发表于《Nature Communications》，为糖链检测工具开发提供了新范式。

研究采用多项关键技术：1)基于CRISPR-Cas9构建糖基化相关基因敲除的HEK293T细胞系；2)建立哺乳动物细胞表面展示系统筛选突变体；3)应用糖芯片(CFG5.5)分析结合特异性；4)通过HL60糖基因CRISPR文库进行正向遗传筛选；5)采用光谱流式细胞术分析外周血细胞糖链表达谱；6)组织微阵列验证组织特异性结合模式。

"Conversion of Fc-pST3Gal1 into the glycan-binding H302A"部分显示，H302A突变体失去酶活但获得唾液酸依赖的结合特性，其结合界面面积(540?²)显著大于传统凝集素(283-502?²)，为高特异性识别奠定结构基础。

"Specific binding to sialyl core-2 O-glycan"通过系列基因编辑细胞证实，H302A特异性结合唾液酸化核心2 O-糖链，不识别MGAT1-KO细胞(缺乏复杂N-糖链)但结合GCNT1-KO细胞(缺乏核心2分支)减弱，这种特性不同于MAL-II等传统凝集素。

"Glycan array"分析表明H302A仅结合两种糖链：唾液酸化核心2 O-糖链(561)和6-硫酸化O-糖链(237)，而PS1主要结合非唾液酸化核心2 O-糖链，证实工程化改造可精确调控结合特异性。

"CRISPR screen"通过负向筛选发现，H302A结合依赖唾液酸合成(NANS/GNE/CMAS/SLC35A1)、核心1(C1GalT1C1/C1GalT1)和核心2(GCNT1)O-糖链合成通路，与ST3Gal4部分相关，揭示了其精确的糖链识别机制。

"Mammalian surface display"创新性地开发了基于DPP4跨膜区的II型膜蛋白展示系统，克服内源糖链干扰，成功筛选出sCore2突变体。结构预测显示A312I/F313S突变可能通过减少空间位阻增强与唾液酸的相互作用。

"Application to cell-surface glycan detection"应用sCore2发现：1)终末效应T细胞和NK细胞高表达唾液酸化核心2 O-糖链，提示其与淋巴细胞分化相关；2)乳腺癌组织腺腔区域强染色，与正常组织形成鲜明对比。

该研究开创性地证明糖基转移酶可经工程化改造为高特异性糖结合蛋白，突破传统凝集素和抗体的局限性。sCore2能精确识别唾液酸化核心2 O-糖链这一重要肿瘤相关抗原，为癌症诊断和免疫治疗研究提供新工具。建立的哺乳动物表面展示平台可推广至其他糖基转移酶改造，有望产生更多"按需设计"的糖链探针。从基础研究角度，这项工作深化了对糖基转移酶结构与功能关系的认识，为糖链识别机制研究提供新视角；从应用角度，sCore2在血液分型、肿瘤诊断等领域展现良好应用前景。Ryoma Hombu等的研究不仅解决糖组学分析工具短缺的燃眉之急，更开辟了糖基转移酶功能重编程的新方向。