细胞穿透肽修饰纳米载体实现高效、批量、非侵入性胚胎转染技术在水产基因工程中的应用

针对水产基因编辑中传统递送系统效率低、侵入性强的问题，华南团队创新性开发了TAT肽修饰的PEG-b-PLGA纳米载体(TNP)。该系统成功实现斑马鱼和凡纳滨对虾胚胎的CRISPR/Cas9非侵入式递送，突破甲壳动物基因编辑技术瓶颈，为水产种质创新提供革命性工具。

　　

水产养殖作为全球增长最快的食品生产领域，正面临基因编辑技术应用的重大瓶颈——传统显微注射等技术难以穿透甲壳类生物的坚硬卵膜，且存在操作复杂、胚胎死亡率高等问题。这种技术困境严重制约了通过基因编辑培育抗病、速生等优良性状水产品种的进程。中国作为贡献全球三分之二水产产量的养殖大国，亟需建立适应不同水生生物特性的高效基因递送平台。

中国水产科学研究院南海水产研究所的研究团队在《Colloids and Surfaces B: Biointerfaces》发表的研究中，开创性地将纳米载体技术与细胞穿透肽相结合。他们设计的新型TNP纳米载体系统，以FDA批准的药用辅料PEG-b-PLGA为基础骨架，表面修饰HIV来源的穿膜肽TAT，并借助阳离子脂质DOTAP实现基因载荷的高效包封。这项技术首次实现了凡纳滨对虾受精卵的CRISPR/Cas9蛋白/sgRNA复合体递送，标志着甲壳类无脊椎动物基因编辑技术的重大突破。

关键技术包括：1）通过开环共聚法合成Mal-PEG-b-PLGA两亲嵌段共聚物；2）TAT肽表面功能化修饰构建TNP载体；3）采用动态光散射和透射电镜表征纳米粒子特性；4）建立斑马鱼和凡纳滨对虾胚胎转染模型；5）通过荧光报告基因和靶向测序验证编辑效率。

【实验动物】
选用120日龄斑马鱼和凡纳滨对虾成熟个体，通过光周期调控诱导自然产卵，收集受精后2小时内的胚胎用于实验。

【合成与表征】
成功制备粒径约150nm、PDI<0.2的球形TNP纳米粒，mRNA包封率达85%以上。TAT修饰使载体表面电位从-15mV转为+8mV，显著增强与卵膜的相互作用。

【结论】
TNP系统在斑马鱼胚胎实现90%以上eGFP-mRNA表达效率，在对虾受精卵中达到23.7%的基因敲除效率，胚胎存活率均超过80%。这种"一锅法"转染策略可同时处理数百枚胚胎，操作时间较显微注射缩短90%。

该研究开创了水产无脊椎动物基因编辑的新范式：1）突破甲壳类卵膜物理屏障，首次实现非侵入式CRISPR递送；2）建立可扩展的批量转染平台，单次处理量达200+胚胎；3）载体材料全部采用药用级原料，生物相容性优异。这项技术将加速抗白斑综合征病毒对虾等重大品种的培育进程，为保障全球水产食品安全提供创新解决方案。研究团队特别指出，该系统可兼容mRNA、siRNA等多种基因载荷，未来有望拓展至贝类、藻类等更多水产经济物种。