基于碱基编辑介导的定向蛋白进化与功能筛选优化获得高效AID 2.1降解系统

研究人员针对现有蛋白降解系统存在基础降解率高、靶蛋白恢复慢等问题，通过系统性比较dTAG、HaloPROTAC、IKZF3和两种AID系统的性能差异，发现OsTIR1-based AID 2.0系统效率最优但仍有缺陷。采用碱基编辑(BE)介导的定向进化策略，筛选获得S210A等OsTIR1功能增益突变体，开发出具有更低基础降解率、更快恢复特性的AID 2.1系统，为动态生物学过程研究提供了更精准的工具。该成果发表于《Nature Communications》。

　　

在生命科学研究中，精确操控蛋白质水平对于理解基因功能至关重要。传统基因敲除技术存在耗时长、无法研究必需基因等局限，而可诱导蛋白降解系统(Inducible protein degradation systems)为解决这些问题带来了希望。然而现有系统普遍存在基础降解泄漏、靶蛋白恢复慢等缺陷，严重制约了它们在动态生物学过程研究和必需基因功能解析中的应用。

针对这一技术瓶颈，来自西北大学(Northwestern University)的研究团队在《Nature Communications》发表重要研究成果。研究人员首先系统比较了五种主流蛋白降解技术（dTAG、HaloPROTAC、IKZF3和两种基于OsTIR1/AtFB2的AID系统）在人类诱导多能干细胞(hiPSC)中的表现，发现OsTIR1(F74G)为基础的AID 2.0系统虽然降解效率最高，但仍存在靶蛋白特异性基础降解和恢复缓慢的问题。为突破这些限制，研究团队创新性地采用碱基编辑(base-editing)介导的突变扫描技术，结合多轮功能筛选，成功开发出性能显著提升的AID 2.1系统。

研究主要运用了以下关键技术：1) CRISPR-Cas9介导的内源基因C端同源重组敲入技术；2) 基于AncBE4max和ABEmax的碱基编辑突变文库构建；3) 流式细胞分选(FACS)引导的三轮功能筛选策略；4) 单细胞RNA测序(scRNA-seq)分析E3连接酶表达谱；5) Incucyte活细胞成像系统定量降解动力学。

研究结果部分，"Comparative analysis of four different inducible degron technologies"显示，在hiPSC中对CTCF和RAD21等内源标记蛋白的比较发现，AID 2.0系统在1μM 5-Ph-IAA处理下1小时内即可实现显著降解，效率远超其他系统。但Western blot分析也揭示其靶蛋白恢复率在48小时后仍不完全，而dTAG系统甚至无法恢复。

"Base editing-mediated mutagenesis screening to evolve an improved AID degron tool"部分详细描述了通过CBE/ABE双编辑器在OsTIR1基因上引入随机突变，经过"高GFP表达-诱导后低GFP-恢复后高GFP"的三轮筛选，获得10个候选突变位点。其中S210A突变在AlphaFold2预测结构中与F74G形成空间对应，共同影响蛋白β-折叠转折区构象。

"Generation and validation of OsTIR1 variants as an efficient degron tool"证实S210A单突变即可降低基础降解，但与F74G组合的AID 2.1效果最佳。流式细胞术显示，AID 2.1系统在10 nM-1μM 5-Ph-IAA范围内均保持高效降解能力，且洗脱后恢复更快。

"AID 2.1 minimizes basal degradation and enhances target protein recovery of endogenous proteins"部分以内源标记的RBBP4为例，证明AID 2.1使基础蛋白水平提高3倍，同时维持快速降解动力学。对必需基因RAD21的拯救实验显示，AID 2.1处理组在洗脱48小时后克隆形成率显著高于AID 2.0。

"AID 2.1 overcomes molecular and cellular defects due to basal degradation"通过转录组分析发现，AID 2.0系统中RBBP4基础降解导致169个基因异常表达，而AID 2.1仅影响64个基因，证实新系统能有效避免由基础降解引起的分子补偿效应。

这项研究通过创新的定向蛋白进化策略，解决了可诱导降解技术领域长期存在的关键问题。AID 2.1系统将基础降解降低至可忽略水平，同时保持快速降解动力学和改善的恢复特性，为研究必需基因功能和动态生物过程提供了更精准的工具。特别值得注意的是，该系统在hiPSC中的优异表现，为干细胞研究和疾病建模开辟了新途径。研究展示的碱基编辑介导的蛋白进化策略，也为其他蛋白工具的优化提供了范式。这些突破性进展将极大促进对基因功能时空调控的理解，并在药物靶点发现和精准医疗领域产生深远影响。