酵母模型揭示SARS-CoV-2主蛋白酶(Mpro)诱导线粒体功能障碍的分子机制

本研究针对SARS-CoV-2主蛋白酶(Mpro)对宿主线粒体的潜在毒性问题，通过构建酿酒酵母基因编辑系统，首次证实Mpro通过切割线粒体相关蛋白导致呼吸链功能受损、膜电位异常及形态学改变。该发现为理解COVID-19中病毒-线粒体互作提供了新视角，并为抗病毒药物开发提供了潜在靶点。

　　

在COVID-19大流行持续影响的背景下，越来越多的证据表明SARS-CoV-2病毒与宿主线粒体的异常互作可能是疾病进展的关键因素。已有研究发现，该病毒至少27种蛋白中的20种会靶向线粒体，引发氧化磷酸化(OXPHOS)抑制、活性氧(ROS)爆发等连锁反应，但具体分子机制尚未阐明。其中，负责病毒复制的关键酶——主蛋白酶(Main protease, Mpro)因其独特的自剪切特性和广泛宿主蛋白切割能力，成为解开这一谜团的重要突破口。

波兰亚当密茨凯维奇大学（Adam Mickiewicz University in Poznan）的研究团队创新性地利用酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)模型，通过CRISPR/Cas9技术构建了GAL1启动子控制的诱导表达系统，首次揭示了Mpro对真核生物线粒体的直接破坏作用。这项发表在《Scientific Reports》的研究表明，具有自剪切活性的Mpro会显著抑制酵母在非发酵碳源条件下的生长，导致线粒体膜电位紊乱、呼吸功能下降及结构异常，为理解COVID-19的线粒体病理机制提供了实验依据。

研究团队主要采用三项关键技术：1）基于CRISPR/Cas9的基因组编辑构建GAL1启动子调控的诱导表达系统；2）设计SAVLQ/D4K双链接策略区分Mpro自剪切活性与毒性效应；3）整合呼吸计量法（氧消耗率OCR）、TMRM膜电位染色和共聚焦显微成像等多维度线粒体功能评估体系。

研究结果

不同碳源对GAL1启动子诱导表达的影响
通过比较葡萄糖、蔗糖、甘油等碳源条件下的EGFP表达水平，发现甘油(YPG)和蔗糖(YPS)培养基能实现最高表达效率，证实该系统在强制有氧呼吸条件下仍保持高效诱导特性。

SARS-CoV-2 Mpro对酵母生长的抑制作用
设计含SAVLQ（可被Mpro自剪切）和D4K（抗剪切）链接的EGFP-Mpro融合蛋白。结果显示，仅在SAVLQ构建体中，活性Mpro的释放导致酵母在依赖线粒体呼吸的YPG/YPEG培养基中生长抑制达数个数量级，而在发酵型培养基中毒性较弱，证明Mpro对线粒体代谢具有特异性破坏作用。

活性Mpro导致线粒体功能障碍
呼吸测量显示，SAVLQ-Mpro菌株24小时后基础呼吸速率（3.50±0.84 vs 1.43±0.43 nmolO₂(mlmin*OD₆₀₀)^-1）和备用呼吸容量显著降低。膜电位分析发现异常线粒体超极化（TMRM过度聚集）和球形结构畸变，伴随ATP合成效率下降（48.93% vs 61.73%基础呼吸），提示Mpro可能干扰线粒体蛋白输入或质量控制系统。

讨论与意义
该研究首次在真核模型中发现SARS-CoV-2 Mpro通过破坏线粒体功能直接导致细胞代谢危机。通过酵母遗传学手段，证实Mpro的自剪切活性是其毒性的关键决定因素——当SAVLQ链接被切割释放天然结构Mpro时，其可靶向线粒体相关蛋白（预测含23个潜在切割位点），这与人类细胞中Mpro干扰MAVS（线粒体抗病毒信号蛋白）等途径的报道形成机制呼应。

这一发现具有双重价值：在基础研究层面，酵母模型为解析病毒-线粒体互作提供了高通量筛选平台；在转化医学层面，Mpro对线粒体的特异性损伤机制为开发针对"长期COVID"（long COVID）线粒体功能障碍的联合疗法提供了新思路。研究团队特别指出，其开发的GAL1诱导系统克服了传统质粒系统需合成培养基的局限，为后续抗Mpro药物筛选奠定了技术基础。