通过代谢工程与培养优化策略实现莱茵衣藻高效合成玉米黄质

本研究针对植物源玉米黄质(zeaxanthin)提取效率低、环境污染严重等问题，通过CRISPR-Cas9基因编辑技术敲除莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)的LCYE和ZEP基因阻断竞争通路，结合β-胡萝卜素羟化酶(CHYB)过表达与乙酸浓度优化，使玉米黄质产量提升190倍至21.68 mg/L，为微藻生物合成高价值类胡萝卜素提供新范式。

　　

在人类健康领域，玉米黄质(zeaxanthin)作为视网膜核心色素，其抗氧化和蓝光过滤功能对防治年龄相关性黄斑变性(AMD)具有不可替代的作用。然而传统从万寿菊中提取的方法面临提取率低（仅0.1%花瓣干重）、季节性供应限制等瓶颈，而化学合成产物又难以满足高端医疗市场需求。这一矛盾促使科学家将目光转向微藻生物合成——莱茵衣藻因其完善的光合系统、清晰的遗传背景，成为理想的"细胞工厂"候选者。

韩国汉阳大学(Hanyang University)生命科学系Junhwan Jang团队联合德国比勒菲尔德大学(Bielefeld University)的研究人员，在《Biotechnology for Biofuels and Bioproducts》发表的研究中，通过多维度工程化改造莱茵衣藻UVM4菌株，实现了玉米黄质产量的突破性提升。研究采用CRISPR-Cas9介导的LCYE（ lycopene epsilon cyclase）和ZEP（zeaxanthin epoxidase）双基因敲除阻断竞争通路，引入优化的β-胡萝卜素羟化酶(CHYB)表达盒增强碳通量，并结合乙酸浓度梯度培养优化，最终使产量达到21.68±0.90 mg/L，相当于亲本菌株的190倍。

关键技术包括：1）利用Cas9核糖核蛋白复合体(RNPs)实现LCYE/ZEP基因精准敲除；2）通过mRuby荧光标记筛选CHYB过表达转化子；3）采用80-100 μmol photons m^-2 s^-1 LED光照与乙酸浓度梯度（17.5-175 mM）优化培养条件；4）HPLC分析类胡萝卜素谱。

基因编辑构建高产底盘菌株
通过敲除LCYE基因（编码 lycopene ε-环化酶）的dL突变体，使α-分支类胡萝卜素（α-胡萝卜素、叶黄素）完全缺失，β-分支代谢流增加2.83倍。进一步敲除ZEP（编码玉米黄质环氧化酶）的dLZ双突变体，阻断玉米黄质向紫黄质的转化，使终产物积累提升至4.54±0.32 mg/L（38倍于野生型）。

CHYB过表达增强羟化效率
在dLZ背景中引入psaD启动子驱动的CHYB-mRuby融合表达盒，使玉米黄质产量达8.20±0.40 mg/L（较dLZ提升80%），F_v/F_m（最大光化学效率）显著恢复，表明类胡萝卜素增加有助于稳定类囊体膜结构。

乙酸浓度梯度优化
在105 mM乙酸条件下，dLZ_C菌株生物量达0.66 g/L，玉米黄质产率提升至6.70 mg/L/day。但超过140 mM时残余乙酸达72.10 mM，盐度升高抑制细胞活性，说明适度碳源调控对平衡生长与产物合成至关重要。

该研究首次在莱茵衣藻中整合基因编辑、代谢通量调控与培养优化策略，使玉米黄质生产率超越目前报道的 Chromochloris zofingiensis（3.07 mg/L/day）。无细胞壁的UVM4底盘菌株更利于下游提取，且产物中不含叶黄素杂质，显著降低纯化成本。这些发现为微藻生物合成高价值色素提供了可扩展的技术路线，对功能性食品、眼科药物开发具有重要应用价值。