基于发根农杆菌介导的CRISPR/Cas9基因编辑系统在香豌豆中的高效建立与应用

本研究针对香豌豆(Lathyrus odoratus)缺乏高效遗传转化体系的难题，开发了发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)介导的CRISPR/Cas9基因编辑系统。研究人员构建了含AtU6-sgRNA和CaMV35S-Cas9表达元件的LoGE1载体，靶向编辑LoPDS和LoSD1基因，分别获得54%和71%的转化效率，编辑效率高达71%和60%。该成果为香豌豆功能基因组研究和分子育种提供了重要技术支撑。

　　

香豌豆以其绚丽的花色和独特芳香成为重要观赏植物，但长期以来缺乏高效的遗传转化体系，严重制约了其功能基因组研究和分子育种进程。传统育种依赖自然突变和杂交选育，而病毒诱导基因沉默(VIGS)等反向遗传学手段存在局限性。针对这一技术瓶颈，上海师范大学植物种质资源开发上海市协同创新中心的研究团队在《Plant Cell, Tissue and Organ Culture (PCTOC)》发表了创新性研究成果。

研究人员采用非无菌条件下的发根农杆菌K599介导转化法，构建了包含AtU6启动子驱动sgRNA和CaMV35S启动子驱动Cas9的LoGE1载体系统。通过靶向编辑控制类胡萝卜素合成的LoPDS基因和株高调控基因LoSD1，建立了香豌豆首例基因组编辑平台。关键技术包括：基于豌豆同源基因设计特异性引物克隆靶基因片段、利用CRISPR-GE在线工具设计sgRNA、GFP荧光标记筛选转化根系，以及DSDecodeM软件解析突变类型。

材料与方法
研究选用'Winter Sunshine Pink'栽培种，通过比较基因组学获得LoPDS和LoSD1部分基因组序列。构建的LoGE1载体整合了sGFP报告基因和NPTII筛选标记，转化效率通过荧光检测评估，编辑效率采用Sanger测序验证。

结果与讨论
转化体系优化显示，LoGE1-PDS和LoGE1-SD1分别获得54%和71%的转化效率。靶位点编辑分析发现，LoPDS位点产生5%纯合、14%杂合和19%双等位突变，LoSD1位点则以40%复杂突变为主。该系统突破性地实现了非无菌操作，且编辑效率显著高于传统方法。

该研究不仅为香豌豆基因功能解析提供了高效工具，其建立的ARM-CRISPR策略对其它观赏植物具有重要参考价值。未来可通过根诱导愈伤组织再生或嫁接技术获得稳定遗传材料，为花色改良、株型调控等育种目标开辟新途径。研究得到崇明区农业科技创新项目(2021CNKC-02-02)资助，相关载体由宁夏大学张宏博士惠赠。