利用CRISPR/Cas9多重编辑芥菜AOP2基因家族实现高附加值萝卜硫苷的突破性生产

这篇研究通过CRISPR/Cas9技术对芥菜（Brassica juncea）的AOP2基因家族进行多重编辑，成功培育出无转基因成分的高萝卜硫苷（glucoraphanin，4MSOB）芥菜品系。编辑后的植株在芽苗、嫩叶和种子中萝卜硫苷含量高达75.10 μmoles/g干重，同时显著降低抗营养性烯丙基硫苷（如progoitrin）。该研究为开发具有抗癌和化学预防功能的超级食品提供了新策略。

　　

摘要

十字花科蔬菜中硫代葡萄糖苷（glucosinolates）的摄入与多种健康益处相关。近年来，萝卜硫苷（glucoraphanin）因其水解产物萝卜硫素（sulforaphane）的抗癌和化学预防特性备受关注。然而，除西兰花外，大多数栽培芸薹属作物中萝卜硫苷含量较低。本研究通过CRISPR/Cas9技术编辑异源四倍体芥菜（Brassica juncea）中ALKENYL HYDROXALKYL PRODUCING 2（BjuAOP2）基因家族，实现了萝卜硫苷的高水平积累。

引言

芸薹属作物是全球重要的油料、蔬菜和调味品来源，其特有的硫代葡萄糖苷是一类含氮和硫的次生代谢产物。萝卜硫苷是研究最广泛的硫苷之一，其水解产物萝卜硫素具有抗氧化、抗炎和抗癌等多种药理活性。然而，除西兰花外，其他芸薹属作物中萝卜硫苷含量较低。芥菜作为一种适应性强的油料作物，含有大量抗营养性硫苷，限制了其作为超级食品的潜力。

结果

BjuAOP2同源基因的进化关系与表达模式

通过系统发育分析发现，芥菜中五个BjuAOP2同源基因与拟南芥AOP2聚为一类，且B亚基因组同源基因表达量显著高于A亚基因组。RT-qPCR分析显示，BjuAOP2.B03在所有组织中表达量最高，而BjuAOP2.A02因插入突变导致蛋白翻译提前终止。

多重编辑实现高萝卜硫苷积累

利用四个gRNA靶向BjuAOP2同源基因的第一外显子，构建了CRISPR/Cas9编辑载体。T₁代种子中萝卜硫苷含量达56.43 μmoles/g干重，占总硫苷的62.78%。突变分析显示，L1事件中所有五个BjuAOP2同源基因均发生移码突变，而低萝卜硫苷事件中部分基因保留功能。

剂量效应与无转基因品系选育

在T₂代中，萝卜硫苷积累呈现剂量效应：编辑4-5个同源基因可使萝卜硫苷占比达71.75%，其中BjuAOP2.A09和BjuAOP2.B01的功能丧失效应最显著。通过Basta敏感性筛选获得的无转基因T₃代植株，在芽苗（41.60 μmoles/g DW）、嫩叶（27.64 μmoles/g DW）和种子（59.21 μmoles/g DW）中均保持高萝卜硫苷含量。

农艺性状与品质分析

编辑品系的种子含油量（37.85%-39.03%）与野生型相当，但蛋白质含量显著提高（21.91%-24.42%）。脂肪酸组成分析显示，有益健康的油酸（C18:1）含量增加至18.14%。田间试验表明，编辑品系的株高、角果性状等农艺参数与野生型无显著差异。

讨论

本研究首次在异源四倍体作物中通过多重基因编辑实现代谢通路的精准调控。与RNA干扰技术相比，CRISPR/Cas9编辑使萝卜硫苷产量提高两倍。芥菜编辑品系的萝卜硫苷含量远超西兰花品种Beneforte?（30.1 μmoles/g DW），为工业化生产萝卜硫素提供了优质原料。该成果不仅拓展了基因组编辑在多倍体作物中的应用，也为开发功能型农产品提供了新范式。

材料与方法

实验采用芥菜品种Varuna为材料，通过农杆菌介导法进行遗传转化。硫苷含量通过HPLC测定，使用DEAE Sephadex-A25柱进行脱硫处理。突变检测采用Sanger测序和ICE分析工具。种子品质参数通过近红外光谱（NIRS）分析。所有田间试验均在隔离网室中进行，符合生物安全规范。