多功能自驱动开关实现无标记CRISPR/Cas12a传感系统用于microRNA直接检测

为解决传统CRISPR/Cas12a系统检测microRNA(miRNA)需逆转录、预扩增和荧光标记的技术瓶颈，研究人员开发了集成靶标识别、CRISPR激活、荧光信号传导和自主信号放大的分子开关。该研究实现了对miR-21的无标记检测（LOD=4.8 nM），在准确性、精密度和选择性方面表现优异，为miRNA床旁检测提供了新策略。

　　

在生命科学领域，microRNA（miRNA）作为一类长度仅19-25个核苷酸的非编码RNA，已成为疾病诊断的"明星分子"。这类小分子通过调控基因表达参与肿瘤发生、心血管疾病等重大疾病进程，其独特的组织特异性表达模式和体液稳定性更使其成为理想的非侵入性生物标志物。以miR-21为例，这种"促癌miRNA"在多种恶性肿瘤中异常高表达，被证实与肿瘤增殖、转移和化疗耐药密切相关。然而，当前miRNA检测的"金标准"qRT-PCR技术存在操作复杂、设备昂贵等缺陷，而新兴的CRISPR/Cas12a系统又受限于必须将RNA靶标转化为DNA激活剂的繁琐步骤。更棘手的是，传统荧光报告系统存在背景干扰强、标记成本高等问题，严重制约了CRISPR技术在miRNA即时检测中的应用。

针对这些技术瓶颈，来自国内研究机构的研究团队在《Systematic and Applied Microbiology》发表了一项突破性研究。他们巧妙设计了一种多功能分子开关，将靶标识别、CRISPR系统激活、荧光信号输出和信号放大四大功能集成于单一分子结构中。这个被称为msCRISPR的创新系统，通过独特的"分子开关"机制实现了对miRNA的直接检测：当miR-21与开关结合时，会触发结构重排暴露出Cas12a激活序列，进而激活Cas12a的"附带切割"活性；被激活的Cas12a又会切割其他完整开关的环区，释放更多激活剂形成自驱动放大循环。与此同时，开关环区设计的G-四链体结构能与荧光染料Auramine O特异性结合产生信号，而Cas12a的切割作用会破坏这种结合导致荧光减弱，从而实现信号输出。

研究人员通过系统优化建立了标准检测流程：首先将样本与分子开关杂交，随后加入预组装的Cas12a/crRNA复合物，经过30分钟反应后检测荧光信号。关键技术包括荧光光谱分析验证开关与染料的结合特性，凝胶电泳确认miR-21诱导的开关构象变化，以及条件优化实验确定最佳反应参数。

研究结果显示，该开关具有多重功能特性：浓度依赖的Auramine O荧光增强证实其作为荧光报告探针的能力；与经典激活剂ssDNA相比，完整开关对Cas12a活性的抑制效率达5倍以上；而添加外源激活剂ssDNA2后，开关作为Cas12a切割底物可使荧光信号降低75%。在miR-21检测中，电泳和荧光分析共同验证了靶标诱导的开关激活机制，优化后的系统对miR-21的检测限达4.8 nM，线性范围25-500 nM。特别值得注意的是，该系统展现出优异的特异性——对miR-122、miR-144等非靶标miRNA的交叉反应可忽略不计，加标回收率保持在99.72%-102.34%之间，精密度RSD低于9.57%。在临床样本验证中，成功检测到骨肉瘤组织中miR-21的显著高表达，证实了其临床应用潜力。

这项研究通过创新的分子设计，首次实现了CRISPR/Cas12a系统对miRNA的直接、无标记检测。其核心价值在于：摒弃了逆转录和预扩增步骤，简化了操作流程；利用内源性G-四链体荧光替代昂贵标记探针，降低成本的同时提高了信噪比；自驱动放大机制使灵敏度媲美传统方法。这种将分子识别、信号转导和放大功能集成于单一结构的策略，为开发下一代分子诊断工具提供了全新思路。随着进一步优化，msCRISPR系统有望推动miRNA检测技术向便携化、平民化方向发展，助力精准医疗在基层医疗机构的落地实施。