基于微型DNA核酸酶IscB的枯草芽孢杆菌高效基因组编辑系统开发及应用

本研究针对枯草芽孢杆菌(B. subtilis) CRISPR-Cas9系统因cas基因过大导致的编辑效率限制，开发了基于微型核酸酶IscB/enIscB的pBsuIscB/pBsuenIscB编辑系统。该系统通过ωRNA引导实现13.3%-100%的基因删除效率，可单次完成169.9 kb大片段删除及多拷贝基因整合，为微生物细胞工厂构建提供了更高效的基因组编辑工具。

　　

基因组编辑技术是改造微生物细胞工厂的核心工具，但传统CRISPR-Cas9系统在枯草芽孢杆菌中的应用面临cas基因过大、操作复杂等瓶颈。近期发现的微型核酸酶IscB（仅Cas9三分之一大小）虽在真核细胞中展现潜力，但其在原核生物尤其是工业菌株枯草芽孢杆菌SCK6中的应用尚未探索。

研究人员通过构建pBsuIscB和pBsuenIscB两套编辑系统，采用xylose诱导启动子P_xylA控制核酸酶表达，结合ωRNA引导和同源重组修复机制，实现了从短片段删除到169.9 kb大片段切除的多层次基因组改造。关键实验技术包括：1）通过转化效率实验验证IscB/enIscB的基因组切割能力；2）设计靶向pyrE/spo0A/bpr等基因的ωRNA及同源臂；3）利用qPCR检测多拷贝mCherry基因整合；4）高温培养法消除编辑质粒。

研究结果显示：

3.1 IscB在枯草芽孢杆菌SCK6中的基因组切割能力

毒性实验表明IscB/enIscB对宿主无显著毒性，其切割效率达10³ CFU/μg DNA。靶向pyrE基因时，pBsuenIscB系统编辑效率较基础版提升2倍。

3.2 建立IscB基因组编辑系统

两套系统对bpr基因均实现100%删除效率，其中pBsuenIscB在spo0A位点的编辑效率达100%，且测序验证了804 bp片段的精确删除。

3.3 大片段删除能力

单次ωRNA引导即可删除37.7 kb的pps操纵子（100%效率）和169.9 kb基因组片段（40%效率），较传统双gRNA策略更高效。

3.4 基因整合应用

在rrn操纵子位点实现3-8拷贝mCherry基因整合，荧光检测显示ctc/epr位点整合株的荧光强度与培养时间正相关。

3.5 二次编辑可行性

通过50℃高温培养成功消除92.3%的编辑质粒，并在Δbpr菌株中完成spo0A基因的二次编辑（13.3-33.3%效率）。

该研究首次将IscB核酸酶应用于原核生物基因组编辑，其小型化特性（496氨基酸）和长TAM序列（5'-CAGGAA-3'）显著提升了编辑特异性。相比传统CRISPR系统，新方法简化了质粒构建流程，单ωRNA即可完成大片段操作，为枯草芽孢杆菌的代谢工程改造提供了更灵活的工具。尤其值得注意的是，在rrn操纵子实现的多拷贝整合策略，为工业菌株的高效异源蛋白表达开辟了新途径。论文发表于《Systematic and Applied Microbiology》，为微生物基因组编辑领域提供了创新性解决方案。