基于甲醇的Bacillus methanolicus模型工程实现从头合成多胺的生物生产

本研究针对CRISPR干扰(CRISPRi)技术静态调控的局限性，开发了可切换向导RNA(gRNA)系统，通过toehold介导的链置换和配体响应型核酶(aptazymes)实现了mRNA或小分子信号介导的基因表达动态调控。研究构建了5'/3'延伸抑制的gRNA锁定机制，开发了rrgRNA和RgA两种调控架构，在酿酒酵母中实现了最高23倍的信号响应范围，并构建了多输入多层级的基因逻辑门电路，为真核系统提供了可逆基因调控新工具。

　　

基因调控领域长期面临静态CRISPR系统的瓶颈问题——传统CRISPR干扰(CRISPRi)技术虽然能精确抑制基因表达，但无法响应细胞内外环境变化实现动态调控。这种"一锤子买卖"式的调控方式严重限制了其在代谢工程、基因治疗等需要时序控制场景的应用。更棘手的是，真核系统中mRNA的亚细胞区室化分布使得核酸信号检测变得异常困难，而小分子感应元件与CRISPR系统的兼容性也一直未能很好解决。

美国华盛顿大学(Washington University in St. Louis)的Tae Seok Moon团队与James M. Carothers合作，在《New Biotechnology》发表的研究中，巧妙融合核酸开关与CRISPR技术，开发出新一代可编程的"智能gRNA"。研究人员借鉴了电子工程中的"与或非"门设计理念，将toehold开关和aptazymes这两种自然界存在的分子传感器嫁接到gRNA骨架，创建了能同时响应mRNA和小分子的双输入调控系统。

关键技术包括：1) 采用NUPACK软件设计gRNA二级结构；2) 构建RgR(核酶-gRNA-核酶)基础架构；3) 开发rrgRNA(核酶救援型gRNA)用于mRNA检测；4) 设计RgA(核酶-gRNA-aptazyme)实现配体响应；5) 在酿酒酵母中通过流式细胞术定量GFP报告基因表达。

【功能表达与CRISPR向导RNA的失活】
研究发现3'端poly-A尾会完全破坏gRNA功能，而5'端修饰则能被Cas9耐受。这促使团队开发了3'端aptazyme调控策略——当配体存在时，aptazyme失活导致poly-A尾保留，使gRNA丧失功能。

【优化gRNA锁定状态实现GFP去抑制】
通过系统优化发现：15nt环(o15)和12nt反义链+9nt反双链(i12+9)组合能完全锁定gRNA。意外的是，+6nt反双链设计反而降低抑制效果，揭示Cas9蛋白结合会影响反义链入侵效率。

【优化可切换gRNA解锁状态用于mRNA传感】
创新性地将toehold开关置于gRNA的5'端上游，开发出trgRNA(趾突救援型gRNA)。当mRNA触发物存在时，toehold介导的链置换会暴露gRNA间隔区，但该设计仅实现3.7倍信号变化。转而采用核酶替代toehold环的rrgRNA设计，将理论最大动态范围提升至30倍。

【toehold调控的gRNA开关被mRNA触发失活】
针对zeoR基因设计的Z3系列rrgRNA将核酶茎从35nt缩短至25nt，其中Z3.2能响应质粒表达的mRNA产生3倍荧光变化。进一步优化的Z4系列采用i12+9架构，六种设计实现了>0.9的标准化荧光，证实+9nt反双链可有效破坏dCas9蛋白结合。

【aptazyme调控的gRNA表达被配体失活】
RgA(Theo)和RgA(Tet)分别响应茶碱和四环素。添加针对gRNA支架连接区的15nt反义RNA(as2)后，信号动态范围从5倍大幅提升至23倍。这种"功能+结构"的双调控策略，使配体浓度与荧光强度呈现典型剂量效应。

【通过多重gRNA开关构建细胞逻辑】
研究成功构建了NIMPLY、AND、NAND和OR四种逻辑门。其中，两层级RgA系统模拟的NIMPLY门(β-雌二醇"与非"配体)实现8倍信号抑制；而整合rrgRNA和RgA的"全合一"设计则实现OR门功能，可同时响应zeoR mRNA和茶碱。

这项研究突破了CRISPR技术静态调控的桎梏，其创新性体现在：1) 首次实现单个gRNA支架同时响应核酸和化学信号；2) 通过结构指导的gRNA支架干扰策略，将真核系统中的信号动态范围提升近5倍；3) 开发的RgR架构具有高度模块化特性，可兼容不同aptazymes和toehold开关。这些成果不仅为代谢工程提供了动态调控工具，更为构建真核细胞生物计算机奠定了基础。特别值得注意的是，研究中发现的i12+9抑制模式，为理性设计gRNA抑制剂提供了新思路，在抗CRISPR(anti-CRISPR)药物开发领域也具有潜在应用价值。