基于Hac1p逆向分泌途径工程改造毕赤酵母提升葡萄糖氧化酶产量的CRISPRi调控策略研究

本研究针对CRISPR干扰(CRISPRi)技术静态调控的局限性，开发了可切换向导RNA(gRNA)系统，通过toehold介导的链置换和配体响应型核酶(aptazymes)实现mRNA/小分子触发的基因表达动态调控。研究人员构建了ribozyme-gRNA-ribozyme(RgR)架构的传感器gRNA，在酿酒酵母中建立了多层级遗传逻辑门，为真核系统可逆基因调控提供了新工具。该成果发表于《New Biotechnology》，为代谢工程和合成生物学提供了创新方法。

　　

基因调控技术正面临从"静态开关"向"动态响应"的范式转变。尽管CRISPR干扰(CRISPRi)技术通过dCas9蛋白和向导RNA(gRNA)的组合实现了基因表达的精准抑制，但其调控方式本质上仍是静态的——一旦gRNA表达，就会持续发挥作用，无法响应细胞内外环境的变化。这种局限性严重制约了CRISPR系统在代谢工程、疾病治疗等需要动态调控场景中的应用。

美国华盛顿大学(Washington University in St. Louis)的Tae Seok Moon团队与James M. Carothers团队合作，在《New Biotechnology》发表了一项突破性研究。他们巧妙地将核酸开关原理与CRISPRi技术相结合，开发出可被mRNA和小分子动态调控的"智能gRNA"系统。这项研究不仅解决了现有CRISPRi技术缺乏环境响应能力的核心问题，更为构建复杂基因调控网络提供了模块化工具。

研究人员采用了三项关键技术：(1)核酶-gRNA-核酶(RgR)架构实现Pol II启动子表达gRNA；(2)toehold介导的链置换设计mRNA响应型gRNA；(3)配体响应型核酶(aptazymes)构建小分子调控开关。实验使用二倍体W303酿酒酵母菌株，通过流式细胞术定量评估GFP报告基因的表达变化。

优化gRNA锁定状态实现GFP去抑制

研究团队首先系统分析了gRNA的结构-功能关系，发现3'端poly-A尾会完全破坏gRNA功能，而5'端修饰则相对耐受。基于此，他们设计了blocked single gRNA(bsgRNA)，通过在5'端添加抑制性反义链锁定gRNA。通过优化环区大小(o15)和反义链长度(i12+9)，实现了超过100%的荧光去抑制效果。

toehold调控的gRNA开关响应mRNA触发

为解决真核系统中mRNA检测难题，团队开发了ribozyme-rescued gRNA(rrgRNA)。当特定mRNA存在时，其通过toehold介导的链置换触发rrgRNA向bsgRNA的转换，释放靶基因抑制。针对zeoR基因设计的Z4.2版本在启动子pPAB1驱动下，实现了3-4倍的荧光变化。

适配体核酶调控的gRNA表达响应配体信号

将HDV核酶替换为theophylline或tetracycline响应的aptazymes，构建了Ribozyme-gRNA-Aptazyme(RgA)系统。添加3'反义链(as2)形成"双旋钮控制"策略后，theophylline诱导的荧光变化提升至23倍。这种组合式调控显著提高了信号动态范围。

构建多层多输入gRNA逻辑电路

研究成功实现了NIMPLY、AND、NAND和OR四种布尔逻辑门。其中，两层RgA架构模拟的NIMPLY逻辑门表现出8倍信号差异，展示了系统在生物计算中的应用潜力。

这项研究突破了CRISPRi技术静态调控的局限，建立了真核系统中可响应环境信号的动态基因调控平台。通过模块化设计，同一gRNA骨架可兼容多种调控模式，为合成生物学提供了高度可扩展的工具箱。特别值得注意的是，该系统可直接检测内源性mRNA，为疾病诊断和代谢工程监测开辟了新途径。未来，通过优化toehold和aptazyme元件，这一平台有望实现更精准的时空特异性调控，推动基因治疗和工业生物技术发展。