酿酒酵母中基于mRNA和小分子触发的条件性向导RNA失活技术开发及其在基因表达动态调控中的应用

本研究针对CRISPR干扰(CRISPRi)技术静态调控的局限性，开发了通过toehold介导链置换和配体响应型核酶(aptazyme)实现的可切换向导RNA(gRNA)系统。该技术利用mRNA或小分子信号实现基因表达的可调控制，在酿酒酵母中构建了多层多输入遗传逻辑门，为真核生物基因回路的动态调控提供了新策略。

　　

基因编辑技术的发展为生命科学研究带来了革命性变革，其中CRISPR干扰(CRISPRi)技术因其精准的基因表达调控能力备受关注。然而，现有CRISPRi系统存在一个关键瓶颈——其调控本质上是静态的，难以实现动态响应环境信号或细胞状态变化的精细控制。在真核生物系统中，这一局限性尤为突出，严重制约了CRISPR技术在代谢工程、基因治疗等领域的深入应用。

针对这一挑战，美国华盛顿大学的研究团队在《New Biotechnology》发表重要研究成果。他们创新性地将合成生物学中的toehold介导链置换(TMSD)和配体响应型核酶(aptazyme)技术整合到CRISPRi系统中，开发出可被mRNA和小分子动态调控的向导RNA(gRNA)开关。这项研究不仅解决了真核生物中基因表达动态调控的技术难题，还为构建复杂遗传逻辑电路提供了全新工具。

研究人员主要采用三种关键技术方法：(1)通过NUPACK软件设计优化gRNA的二级结构；(2)构建Ribozyme-gRNA-Ribozyme(RgR)融合架构实现核酶介导的gRNA加工；(3)开发Ribozyme-rescued gRNA(rrgRNA)和Ribozyme-gRNA-Aptazyme(RgA)系统分别响应mRNA和小分子信号。实验在二倍体W303酿酒酵母菌株中进行，通过流式细胞术定量分析报告基因表达变化。

在"功能性表达和CRISPR向导RNA的失活"部分，研究首次发现5'端修饰对gRNA功能影响较小，而3'端poly-A尾会完全抑制gRNA活性。这一发现为后续设计3'端调控元件提供了关键依据。

"优化gRNA锁定状态以实现GFP去抑制"的研究中，团队系统评估了不同环大小(i15+6和i12+9设计)对gRNA抑制效率的影响，确定15nt环结构能实现完全抑制，这为后续传感器设计确立了结构参数。

关于"优化可切换gRNA解锁状态用于mRNA传感"，研究创新性地将toehold开关置于gRNA的5'端上游，开发出rrgRNA系统。实验证明靶向zeoR mRNA的Z3.2设计能产生3倍荧光变化，验证了该策略的可行性。

在"aptazyme调控的gRNA表达通过配体失活"章节，研究人员将3'HDV核酶替换为茶碱/theophylline(Theo)和四环素(Tet)响应的aptazyme，并引入3'反义链(as2设计)形成双重控制，使荧光变化提升至23倍，显著提高了调控灵敏度。

最后在"通过多重gRNA开关构建细胞逻辑"部分，研究成功实现了NIMPLY、AND、NAND和OR等多种布尔逻辑门。特别是Ribozyme-rrgRNA-Aptazyme(RrrgA)架构可同时响应mRNA和配体信号，展示了该系统的高度模块化特性。

这项研究的突破性在于首次在真核生物中实现了CRISPRi系统的动态闭环控制。通过巧妙整合toehold开关、aptazyme和反义RNA技术，研究人员建立了可响应内源mRNA和外源小分子的多功能调控平台。该技术不仅解决了现有CRISPRi系统缺乏动态响应能力的核心问题，其模块化设计更为构建复杂基因调控网络提供了标准化"元件"。未来，这一技术可望应用于代谢途径动态优化、基因治疗精准调控等领域，推动合成生物学和精准医学的发展。值得一提的是，研究中发现的gRNA结构-功能关系(如15nt环的稳定作用)为RNA工程提供了重要设计原则，具有广泛的指导意义。