基于T7 RNA聚合酶与CRISPR/Cas13a增强电化学发光生物传感器的MMP-2超灵敏检测及其在COPD诊断中的应用

本研究针对慢性阻塞性肺疾病（COPD）关键生物标志物MMP-2检测灵敏度不足的问题，开发了一种整合T7 RNA聚合酶扩增与CRISPR/Cas13a信号增强的电化学发光（ECL）生物传感器。通过设计特异性响应MMP-2切割的肽核酸（PNA）探针，结合AuNPs/Ti3C2Tx/Ru(II)-PEI纳米复合材料，实现了62.05 fM的超低检测限，为COPD早期诊断提供了高效工具。

　　

慢性阻塞性肺疾病（COPD）作为全球第三大死因，其早期诊断一直面临生物标志物检测灵敏度不足的挑战。基质金属蛋白酶-2（MMP-2）是驱动COPD气道重塑的关键效应分子，但现有检测方法如ELISA和荧光探针存在操作繁琐、抗干扰能力差等缺陷。尤其对于早期患者，其生物样本中MMP-2浓度常低于传统方法的检测下限，亟需开发更灵敏的检测技术。

苏州工业园区金鸡湖医学人才计划支持的研究团队在《Methods》发表创新成果，通过分子工程与纳米技术融合，构建了"三位一体"的超灵敏检测平台。该研究巧妙设计了可被MMP-2特异性切割的肽核酸（PNA）分子开关，将蛋白酶活性转化为核酸信号；继而利用T7 RNA聚合酶的体外转录扩增能力产生大量RNA激活子；最终通过CRISPR/Cas13a系统的"附带切割"效应实现信号指数级放大。电极界面采用Ru(bpy)₃²⁺修饰的AuNPs/Ti₃C₂T_x纳米复合材料，显著提升了电子传递效率和信号稳定性。

关键技术包括：1）MMP-2响应型PNA探针设计；2）T7 RNA聚合酶介导的等温转录扩增；3）CRISPR/Cas13a collateral cleavage信号放大系统；4）AuNPs/Ti₃C₂T_x纳米复合电极构建；5）人血清样本验证（回收率98.2%-103.7%）。

【研究结果】

1. 材料与化学试剂：

   通过PAGE纯化的DNA模板与商业化的Cas13a蛋白组成核心检测元件，Ti₃C₂T_x MXene材料经PEI修饰后显著提升Ru(bpy)₃²⁺负载量。

2. 生物传感器原理：

   MMP-2切割PNA探针释放DNA模板，经T7转录产生RNA激活Cas13a，后者切割电极表面信号报告分子导致ECL增强。AuNPs/Ti₃C₂T_x基质使信号强度提升3.8倍。

3. 性能验证：

   在0.1-1000 pM范围内呈现优异线性关系，检测限达62.05 fM，较ELISA灵敏度提高6个数量级。对10种类似蛋白的交叉反应性均<3.2%。

【结论与意义】

该研究突破传统酶标法的灵敏度瓶颈，首次实现MMP-2活性与核酸扩增技术的耦合。相较于Tang等报道的三级放大系统，本研究简化为PNA-T7-Cas13a二级级联，电极制备省略了光开关分子修饰步骤，更适合临床转化。在20例COPD患者血清检测中，其结果与CT影像学评分高度一致（R²=0.91），为呼吸系统疾病的分子分型提供了新工具。这种模块化设计可拓展至其他蛋白酶检测，为精准医疗提供通用技术平台。