四基因缺失伪狂犬病毒载体构建及非洲猪瘟抗原递送系统的免疫评价

本研究利用CRISPR/Cas9技术构建了缺失UL24/TK/gI/gE四基因的重组伪狂犬病毒(rPRV)载体，成功表达了非洲猪瘟病毒(ASFV)的p54、p72、CD2v和pp62抗原。动物实验证实该重组病毒株具有良好安全性，能诱导强烈的体液和细胞免疫应答，为开发抗ASFV和PRV的双价疫苗提供了新策略。

　　

非洲猪瘟(ASF)是由非洲猪瘟病毒(ASFV)引起的高度致死性传染病，自2018年传入中国后对养猪业造成巨大经济损失。由于ASFV基因组复杂且缺乏商业疫苗，开发安全有效的疫苗成为当务之急。本研究创新性地利用四基因缺失的重组伪狂犬病毒(PRV)作为载体，构建了两种表达ASFV抗原的重组病毒株。

在材料与方法部分，研究团队采用CRISPR/Cas9基因编辑技术，将ASFV的p54、p72、CD2v和pp62基因插入PRV SX-10株的UL24/TK和gI/gE基因缺失位点，成功构建了rPRV-p54+p72和rPRV-CD2v+pp62两种重组病毒。Western blot和免疫细胞化学证实这些外源蛋白在BHK-21细胞中高效表达。通过20代连续传代实验验证了重组病毒的遗传稳定性。

生物学特性分析显示，重组病毒株保持了与亲本株相似的生长特性，但形成的噬斑较小。单步生长曲线表明重组病毒滴度略低于亲本株。免疫组化检测证实重组病毒能在小鼠脾脏中有效表达ASFV抗原。

小鼠免疫实验取得了显著成果。与PRV SX-10组相比，重组病毒免疫组小鼠未出现瘙痒、脱毛等临床症状，存活率达100%。ELISA检测显示免疫小鼠产生了高水平的PRVgB特异性抗体，以及针对p54、p72、CD2v和pp62的特异性抗体。细胞免疫分析发现免疫小鼠脾脏中IL-2、IL-4和IFN-γ水平显著升高，CD3⁺、CD4⁺和CD8⁺T细胞比例明显增加。攻毒实验证实重组病毒能完全保护小鼠抵抗PRV强毒株攻击。

在仔猪实验中，重组病毒同样表现出良好安全性，接种猪只未出现临床症状，体温保持正常。血清IFN-γ水平显著升高，外周血单个核细胞(PBMCs)在ASFV抗原刺激下呈现强烈增殖反应。组织病理学检查未发现明显病变。ELISA检测证实仔猪产生了针对PRVgB和ASFV抗原的特异性抗体。

讨论部分指出，该研究创新性地将PRV载体与ASFV多抗原组合策略相结合。PRV载体具有基因组大、外源基因容量高等优势，而选择的ASFV抗原(p54、p72、CD2v和pp62)都是能诱导保护性免疫的关键抗原。研究证实该疫苗平台能同时激活体液和细胞免疫，特别是诱导了高水平的IFN-γ和T细胞应答，这对抵抗ASFV感染至关重要。

这项研究为开发抗ASFV和PRV的双价疫苗提供了重要实验依据。未来研究将着重评估该疫苗对ASFV强毒株的攻毒保护效果，并优化抗原组合和免疫程序，以进一步提高疫苗效力。该疫苗策略不仅对ASF防控具有重要意义，也为其他重要动物疫苗的研发提供了新思路。