利用多重CRISPR激活技术实现细胞特异性黄酮醇高效合成的新策略

本研究针对植物合成生物学中多基因协同表达的技术难题，开发了一种基于CRISPRa-Suntag系统的细胞特异性基因激活平台。研究人员通过优化dCas9-Suntag-VP64系统，在拟南芥根内皮层中成功激活了6个黄酮醇合成通路基因（4CL3/CHS/CHI/F3H/FLS1/TT7），在myb12突变体中重建了野生型水平的黄酮醇合成能力。该研究为植物代谢工程提供了精准可控的多基因调控工具，发表在《Nature Communications》。

　　

在植物合成生物学领域，如何实现多基因的精准时空调控一直是重大技术挑战。传统方法依赖转录因子过表达，但这种方式会同时激活数百个下游基因，犹如"大锤敲钉"般缺乏精确性。而现有的CRISPR激活（CRISPRa）系统虽然在瞬时表达或泛表达场景表现良好，却难以在特定细胞类型中实现稳定高效的基因激活。这种技术瓶颈严重限制了复杂性状的合成改造，特别是在需要精确控制代谢通路时空表达的植物代谢工程领域。

瑞士洛桑大学（University of Lausanne）的Anaxi Houbaert等研究人员在《Nature Communications》发表的研究，通过系统优化CRISPRa技术，成功实现了植物细胞类型特异性的多基因协同激活。他们选择黄酮醇生物合成通路作为模型，因为这个涉及6个酶促反应的代谢网络需要所有组分精确协调表达才能产生终产物。

研究团队首先建立了基于荧光报告基因的细胞特异性激活评估系统。通过比较dCas9-Suntag、dCas9-TV和dCas9-Act2.0三种CRISPRa系统在拟南芥根内皮层的表现，发现去除超折叠GFP的简化版Suntag系统（dCas9-Suntag-VP64）激活效率最高。该系统采用双组分设计：dCas9融合10×GCN4表位尾，与携带VP64激活域的scFv抗体片段结合。研究人员进一步测试了17种激活域（包括植物来源的2xTAD和15个新发现的AD），发现VP64仍保持最强激活能力，但2xTAD表现更稳定。

为验证系统实用性，研究人员选择黄酮醇合成通路进行重构。在myb12突变体（缺乏根部黄酮醇合成能力）背景下，通过内皮层特异性PERO3启动子驱动CRISPRa系统，靶向激活4CL3、CHS、CHI、F3H、FLS1和TT7六个基因的启动子。研究采用严格的"双轨"筛选策略：先通过单基因报告系统验证每个gRNA效率，再建立稳定表达CRISPRa组件的株系。通过DPBA荧光染色证实，成功激活的株系能重建野生型水平的黄酮醇（山奈酚和槲皮素）合成，且代谢产物积累具有细胞特异性。

研究结果部分显示：

"Endodermis specific transcriptional activation using CRISPRa Suntag"证实简化版Suntag系统在内皮层能高效激活GPAT2、GPAT3和LOVE1启动子，荧光信号强度与内源表达相当。正交视图显示激活严格限定在内皮层细胞核。

"Workflow for successful multiplexed gene activation"展示通过稳定株系预筛选和gRNA单独验证的策略，解决了多基因激活中的表达变异问题。qPCR显示六个黄酮醇通路基因在内皮层被协同激活。

"Reconstitution of the flavonol biosynthetic pathway"部分通过DPBA染色证实，-TT7组只产生绿色荧光的山奈酚，+TT7组则同时检测到红色荧光的槲皮素，证明通路完整重建。有趣的是，黄酮醇在内皮层的积累晚于PERO3启动子活性出现，暗示存在代谢物转运过程。

这项研究的意义在于：技术上，建立了首个能稳定实现植物细胞特异性多基因激活的CRISPRa平台，其模块化设计便于扩展应用；生物学上，证实六个核心酶足以在非自然细胞环境中重建完整代谢通路；应用层面，为精准代谢工程提供了新工具。研究者特别指出，这种"bottom-up"的酶组合策略比转录因子介导的"top-down"方法更能精确控制代谢流向。该技术有望应用于作物品质改良、药用化合物生产等领域，特别是需要复杂代谢网络重编程的场景。