基于CRISPR激活筛选揭示KRAB结构域转录因子ZIM3和ZNF394调控人类合子基因组主激活的新机制

本研究通过CRISPR激活筛选技术，在人类扩展多能干细胞(hEPSCs)中系统鉴定出132个潜在调控合子基因组主激活(major ZGA)的转录因子，重点揭示了KRAB结构域蛋白ZIM3和ZNF394通过抑制4C期胚胎特异性基因表达促进人类8细胞期胚胎发育的关键作用。研究人员利用3PN人类胚胎模型证实双敲降会导致50% major ZGA基因激活失败，为理解灵长类早期发育的表观遗传调控提供了新视角。

　　

在生命起始的奥秘中，合子基因组主激活(major ZGA)如同胚胎发育的"开机键"，激活数千个合子基因并建立全能性。然而与斑马鱼、果蝇等模式生物相比，人类major ZGA的调控机制长期笼罩在迷雾中。虽然近年通过测序技术发现了DUX4、TPRXs等部分调控因子，但PRD家族成员敲降仅能延迟而非完全阻断胚胎发育，暗示人类ZGA调控网络的复杂性。由于伦理限制难以直接在人类胚胎开展大规模筛选，北京大学医学部基础医学院细胞生物学系的研究人员另辟蹊径，利用具有胚胎和胚外发育潜能的人类扩展多能干细胞(hEPSCs)作为替代模型，展开了一场转录因子的"大海捞针"。

研究团队首先构建了DUXA-GFP报告系统，采用覆盖1603个人类转录因子的CRISPR激活文库进行筛选，通过7天多西环素诱导后分选GFP阳性细胞。测序数据分析锁定132个候选因子，其中KRAB结构域转录因子ZIM3和ZNF394因在8细胞期胚胎特异性高表达脱颖而出。为验证其功能，研究人员运用RNA测序、ATAC-seq、CUT&RUN等多组学技术，结合人类3PN胚胎模型进行系统解析。

ZIM3或ZNF394过表达诱导全能性特征

过表达实验显示，ZIM3和ZNF394能显著激活DUXA、ZSCAN4等经典全能性标志基因，上调80%的8细胞期特异性基因。有趣的是，这些被激活的8细胞期基因与已知调控因子TPRX1或DUX4的靶基因重叠率不足20%，提示存在新的调控通路。GO分析揭示这些基因富集于RNA剪接、翻译等8细胞期特征性生物学过程。

共过表达引发表观遗传重塑

ZIM3/ZNF394共表达导致全基因组染色质可及性降低，特别是4C期胚胎和hESC高表达基因的启动子区域。CUT&RUN分析显示H3K9me3和H3K27me3抑制性标记在这些位点富集，而活性标记H3K4me3减少。Motif分析发现多能性因子OCT4/SOX2/NANOG的结合活性降低，8C特异性因子YY1/CTCF则增强。

鉴定类8CLC亚群

单细胞转录组分析发现，ZIM3+ZNF394+的8CLC(8细胞样细胞)亚群在发育轨迹上更接近E3-E4期胚胎，CytoTRACE2预测其发育潜能高于常规8CLC。定向分化实验显示该亚群向滋养外胚层(TE)分化的能力显著增强，75%的TE枢纽基因表达上调。

胚胎发育验证关键功能

在人类3PN胚胎中双敲降ZIM3/ZNF394导致40%胚胎停滞在8细胞期前，49.36%的major ZGA基因激活失败。单细胞转录组显示敲降胚胎更接近4C期发育状态，伪时间分析证实其发育进程延迟。值得注意的是，敲降同时引起882个4C期特异性基因异常激活，暗示这些KRAB蛋白通过抑制前期发育程序促进ZGA转换。

KRAB结构域的功能解析

KRAB结构域缺失突变体实验表明，该结构域对诱导全能性特征至关重要——缺失后8C期标志基因激活显著减弱。生物信息学预测发现，ZNF394特异性结合LTR14B(pre-8C期转座元件)，而ZIM3/ZNF394在hEPSCs中可能调控524个4C期特异性基因，其中20%受KRAB域介导的转录抑制。

这项发表于《Cell Reports》的研究首次系统绘制了人类major ZGA调控网络图谱，揭示KRAB结构域转录因子通过"双重调控"机制——既激活8C期发育程序又抑制4C期基因表达——精确控制合子基因组激活的时空秩序。研究发现28%的人类8C期特异性转录因子含有KRAB结构域，且在猕猴胚胎中观察到类似表达模式，提示该调控机制在灵长类中的保守性。北京大学邓宏魁团队建立的hEPSCs模型为突破人类胚胎研究伦理限制提供了新范式，而ZIM3/ZNF394的发现不仅丰富了发育生物学理论，也为提高体外受精成功率等临床应用提供了潜在靶点。