基于CRISPR/Cas12a与熵驱动放大的高灵敏度单细胞电化学发光生物传感器

为解决单细胞检测中灵敏度不足和操作复杂的问题，研究人员开发了一种整合CRISPR/Cas12a与熵驱动放大的均相电化学发光(ECL)生物传感器，实现了对HEK293细胞中hERG钾通道的单分子级检测，信号无需平均即可识别，为肿瘤研究和分子诊断提供了新工具。

　　

在生物医学研究中，单细胞分析正成为揭示细胞异质性的关键手段，但现有技术如流式细胞术和单细胞测序面临灵敏度低、成本高或破坏样本等问题。尤其对于广泛使用的HEK293细胞，其单细胞水平的检测仍存在技术瓶颈。针对这一挑战，无锡市人民医院（Wuxi People's Hospital）的研究团队在《Bioelectrochemistry》发表了一项创新研究，开发出整合多重信号放大策略的电化学发光(ECL)生物传感器。

研究采用四大核心技术：光裂解DNA-抗体偶联物实现靶向定位，熵驱动链置换反应(Entropy-driven amplification)触发级联反应，T7 RNA聚合酶介导转录扩增，以及CRISPR/Cas12a的trans-cleavage（反式切割）活性实现信号转换。通过优化酶浓度、反应时间等参数，系统在0-1.3 V电压扫描下记录ECL信号。

材料与方法

使用转染hERG的HEK293细胞系，以抗hERG抗体和光裂解DNA1构建探针。当靶细胞存在时，紫外光释放DNA1触发熵驱动反应，生成T7启动子序列。T7 RNA聚合酶随后转录产生RNA激活剂，引导Cas12a切割标记单链DNA，最终在ITO电极表面产生ECL信号。

结果验证

1. 单细胞灵敏度：系统可检测单个HEK293细胞，ECL强度与细胞数呈线性关系（R²>0.99）。

2. 特异性控制：对比HeLa、A549等细胞系及错配DNA序列，背景信号差异显著（p<0.01）。

3. 机制优化：确定Cas12a最佳浓度为50 nM，反应时间30分钟时信噪比达峰值。

结论与意义

该研究首创性地将CRISPR/Cas12a与ECL技术结合，通过"ETS-Cas"（Entropy-driven triggered T7 amplification-Split CRISPR/Cas12a）系统实现单细胞检测。其创新点在于：① 利用光控释放DNA避免非特异性结合；② 级联放大使信号提升10³倍；③ 均相检测省去繁琐分离步骤。这项技术为肿瘤微环境研究、循环肿瘤细胞检测提供了新思路，尤其适用于资源有限地区的分子诊断。研究获得无锡市卫健委"飞燕人才"计划（2025-YZ-HBDTR-WJY-2025）等多项基金支持，展现了临床转化潜力。