基于CRISPR-Cas9系统的病毒基因组敲入细胞系快速构建及感染性病毒高效制备新策略

针对难培养病毒的研究瓶颈，研究人员利用CRISPR-Cas9系统在AAVS1安全港位点构建了携带HBV（A/B/C/D型）和HEV全基因组的Huh7稳定细胞系。该体系经多西环素诱导可高效表达病毒基因组和蛋白，产生的病毒颗粒具有感染性且可被中和抗体阻断。该技术为病毒学研究、抗病毒药物筛选及疫苗研发提供了通用型平台。

　　

在病毒学研究领域，许多具有重要医学价值的病毒如乙型肝炎病毒（HBV）和戊型肝炎病毒（HEV）难以通过传统宿主系统有效扩增，这严重制约了病毒特性解析、抗病毒药物开发和疫苗研制进程。现有技术包括原代细胞培养、类器官模型和动物实验都存在效率低、成本高或伦理限制等问题。尤其对于依赖肝细胞特异性因子（如NTCP受体）的HBV，以及因高突变率导致培养困难的RNA病毒，建立稳定高效的体外培养体系一直是学界亟待突破的难题。

Shiv Nadar杰出学院（国内研究机构）的研究团队在《Journal of Virological Methods》发表创新成果，首次利用CRISPR-Cas9基因编辑技术，在人类肝癌细胞系Huh7的AAVS1（腺相关病毒整合位点1）安全港位点精准整合了1.3倍体HBV基因组（A-D型）和HEV全基因组。该研究构建的稳定细胞系经多西环素诱导后，可持续产生具有感染性的病毒颗粒，且病毒产量显著高于传统方法。通过验证病毒聚合酶抑制剂和IFN-α对病毒复制的抑制作用，以及中和抗体的阻断效果，证实该体系能高度模拟自然感染过程。这项技术为难培养病毒的研究提供了标准化解决方案，对加速抗病毒药物筛选和疫苗研发具有重要价值。

关键技术方法包括：1）采用增强型en1FnCas9核酸酶（源自Francisella novicida）与sgRNA共表达系统进行靶向编辑；2）将病毒基因组与四环素响应启动子、嘌呤霉素筛选标记构建于供体质粒；3）通过PCR验证基因组整合；4）使用HepG2-NTCP-A3和S10-3等易感细胞系评估病毒传染性；5）采用病毒学（基因组定量）和免疫学（蛋白检测）方法评估抗病毒药物效果。

【结果】

1. 细胞模型构建：成功建立携带多基因型HBV和HEV基因组的Huh7细胞系，病毒基因组在AAVS1位点实现定向整合，多西环素诱导后病毒RNA表达量提升20倍。

2. 抗病毒验证：病毒聚合酶抑制剂使HBV DNA产量降低90%，IFN-α处理使HEV ORF2蛋白表达减少85%，证实编辑细胞保留了病毒复制的关键调控机制。

3. 感染性分析：编辑细胞释放的病毒可感染HepG2-NTCP-A3细胞（HBV）和S10-3细胞（HEV），且感染率与临床分离株相当；针对HBV表面抗原和HEV衣壳蛋白的中和抗体能完全阻断病毒感染。

【讨论】该研究突破性地将CRISPR-Cas9技术与病毒学需求相结合：1）AAVS1位点的选择保障了基因组稳定性；2) 四环素诱导系统实现病毒复制的可控性；3) en1FnCas9较传统SpCas9展现更高编辑效率。特别值得注意的是，该平台可扩展至HCV基因3型等难培养病毒，甚至适用于登革热等可培养病毒的疫苗生产优化。研究团队强调，这种"病毒基因组敲入"策略比传统转染或感染方法更接近自然感染状态，为研究病毒-宿主互作提供了理想模型。

这项由Harshita Katiyar、Ishika Agrawal等完成的研究，不仅解决了HBV/HEV研究的重大技术障碍，其模块化设计理念（如可替换的sgRNA和供体载体）更为其他病毒研究提供了标准化技术框架。随着该技术在疫苗生产领域的应用拓展，或将显著降低病毒性疫苗的生产成本和时间周期。