基于RAA-CRISPR/Cas12a双模式系统的鲤春病毒血症病毒(SVCV)便携式一体化检测技术开发与应用

为解决鲤春病毒血症病毒(SVCV)现场检测难题，上海海洋大学团队开发了集成重组酶辅助扩增(RAA)、CRISPR/Cas12a和侧流层析试纸(LFD)的双模式检测系统。该研究通过优化crRNA探针与蔗糖双相反应体系，实现37℃条件下90分钟内完成检测，灵敏度达6.04×100 copies/μL，临床样本验证显示与传统PCR 100%吻合，为水产疫病防控提供了突破性现场解决方案。

　　

在全球水产养殖业面临鲤春病毒血症病毒(SVCV)的严重威胁背景下，这种被世界动物卫生组织(WOAH)列为必须通报的病原体，每年造成数十亿美元经济损失。SVCV属于弹状病毒科(Rhabdoviridae)鲑鱼弹状病毒属(Sprvivirus)，其典型子弹状病毒粒子可通过水体快速传播，感染鲤科鱼类后引发全身出血性疾病，死亡率高达70%。尽管传统PCR和细胞培养方法已被纳入中国国家标准(GB/T 15805.5–2018)，但这些技术依赖实验室设备且需4-6小时完成检测，难以满足养殖场实时监测需求。

上海海洋大学国家水生动物病原库的研究团队在《Aquaculture Reports》发表创新成果，开发出集重组酶辅助扩增(RAA)与CRISPR/Cas12a于一体的双模式检测系统。该研究突破性地采用蔗糖密度梯度实现单管双相反应，通过靶向SVCV高度保守的糖蛋白(G)基因序列，结合侧流层析试纸(LFD)可视化读值，建立了从核酸提取到结果判读的完整现场检测方案。关键技术包括：1)基于多序列比对筛选出最佳RAA引物对F2/R2和crRNA2-2；2)优化20 nM FAM-生物素双标记ssDNA探针；3)建立含3.53 mg蔗糖的封闭式反应体系避免交叉污染；4)采用铁基絮凝技术预处理环境样本。

研究结果显示：在灵敏度验证中，荧光法与LFD法分别检出6.04×10²和6.04×10⁰ copies/μL的质粒标准品，较国家标准方法灵敏度提升1000倍。特异性实验证实，该系统对鲤疱疹病毒2型(CyHV-2)、草鱼呼肠孤病毒(GCRV)Ⅰ-Ⅲ型等常见病原体均无交叉反应。30份临床样本检测结果与嵌套PCR完全一致，其中20份阳性样本的检出符合率达100%。尤为突出的是，LFD版本仅需10分钟显色即可肉眼判读，且无需任何专业设备。

讨论部分指出，该研究的创新价值体现在三个方面：首先，蔗糖稳定化双相系统解决了传统CRISPR检测开管操作导致的污染问题；其次，通过crRNA序列优化将检测时间压缩至90分钟，较常规RT-PCR缩短75%；最后，双模式设计既可满足实验室精准定量需求，又能适应野外无电源环境。研究人员也坦承当前系统在绝对定量方面存在局限，建议未来结合数字CRISPR技术改进。这项技术已在中国主要水产养殖区开展示范应用，为WOAH跨境疫病监测提供了符合"One Health"理念的创新工具，对保障全球水产食品安全和生态安全具有重要实践意义。