PAXX/Ku相互作用稳定性决定需末端加工的双链DNA断裂修复速率

本研究揭示了PAXX蛋白K193R突变通过稳定与Ku70/80的DNA非依赖性结合，显著加速需末端加工的双链断裂（DSB）的经典非同源末端连接（c-NHEJ）修复进程，首次证明NHEJ复合体稳定性是DSB修复的限速步骤，为DNA修复工程提供了新靶点。

　　

在生命活动中，双链DNA断裂（DSB）是最致命的DNA损伤类型，会直接破坏基因组的完整性。面对这种威胁，哺乳动物细胞进化出了两种主要修复机制：需要模板的同源重组（HR）和无需模板的经典非同源末端连接（c-NHEJ）。其中c-NHEJ是静止期细胞修复DSB的主要途径，其缺陷会导致免疫功能障碍和神经元发育异常。尽管科学家已阐明c-NHEJ的基本流程——从Ku异源二聚体识别断裂端，到DNA-PKcs募集，再到PAXX、XLF等辅助因子参与的末端加工，最后通过Ligase IV完成连接——但整个修复过程中是否存在限速步骤仍不清楚。

英国医学研究委员会（Medical Research Council）的Michal Malewicz团队在《Journal of Biological Chemistry》发表的研究给出了关键答案。研究人员通过系统性突变PAXX蛋白的7个赖氨酸位点，意外发现K193R突变会导致PAXX与Ku70/80形成异常稳定的复合体，并共同错误定位于核仁。令人惊讶的是，这种"功能获得性"突变能特异性加速需要末端加工的DSB（如辐射诱导的断裂）修复，而对可直接连接的"干净"断裂无影响。这首次证明NHEJ复合体的稳定性是决定DSB修复速度的关键因素。

研究主要采用免疫共沉淀分析蛋白互作、电泳迁移率变动实验（EMSA）检测DNA-蛋白复合物、免疫荧光追踪蛋白定位、γH2A.X焦点计数评估修复效率，以及冷冻电镜解析PAXX-Ku相互作用结构。

【突变赖氨酸揭示关键位点】

通过将PAXX所有7个赖氨酸替换为精氨酸（7KR），发现K193R单突变即可重现7KR的核仁定位表型。生化实验显示K193R突变使PAXX与Ku70的结合不再依赖DNA，且能强力稳定Ku与DNA的单体复合物。

【核仁滞留的分子机制】

冷冻电镜结构解析显示，R193侧链与Ku80的M427/L430主链羰基及Ku70的E250形成额外氢键网络。引入破坏PAXX-Ku互作的F201A突变可消除核仁定位，证实该现象源于异常稳定的蛋白互作。

【加速特定类型DSB修复】

在氧化损伤（zeocin）和辐射诱导的DSB修复中，K193R突变细胞8小时内的修复效率显著高于野生型。但对拓扑异构酶II抑制剂（etoposide）诱导的"干净"断裂，两者无差异。体外连接实验和CRISPR产生的断裂测序也证实，该突变仅影响需末端加工的DSB修复。

这项研究开创性地揭示了NHEJ修复的速度调控机制：PAXX-Ku相互作用的稳定性是决定需末端加工DSB修复速度的"分子刹车"。这一发现不仅解释了核仁区主动排除NHEJ组分的可能原因——防止重复序列rDNA的错误修复，更为DNA修复工程提供了新思路。虽然K193R突变因导致组成性核仁定位而难以直接应用，但精准调控PAXX-Ku界面有望开发出"加速版"NHEJ工具，在基因编辑和放射防护领域具有潜在价值。研究还暗示细胞可能通过赖氨酸修饰（如乙酰化）动态调节K193的电荷状态，从而精细控制修复速度与准确性的平衡——这将成为团队后续探索的重要方向。