CRISPR/Cas9突变技术生成了一种新型产量基因An-1的优良等位基因，该基因能够显著增加水稻（Oryza sativa L.）的粒数

《Current Plant Biology》：CRISPR/Cas9 mutagenesis generated elite alleles of a novel yield gene An-1 leading to increased grain number in rice ( Oryza sativa L.)

水稻增产基因编辑研究：利用CRISPR/Cas9技术创建An-1基因突变体，通过多代遗传稳定性分析和农艺性状评估，发现突变体显著增加分蘖数、穗粒数和单株产量，为水稻增产提供了新候选基因。

　　水稻（*Oryza sativa* L.）的驯化历史可以追溯到约8000年前，当时通过人工选择开始对产量性状进行筛选。随着全球对水稻需求的增长、产量趋于平稳以及气候变化的影响，提高水稻的产量潜力对于保障粮食安全显得尤为重要。因此，识别控制产量性状的基因及其机制，如C4光合作用，是实现水稻产量持续增长的关键。本研究通过CRISPR/Cas9基因编辑技术，尝试创造一个新的驯化基因*An-1*的靶向突变，以增强水稻的产量潜力。通过对一个水稻品种ASD 16的312个T0后代进行评估，发现存在17个多重等位基因突变、7个双等位基因突变和4个单等位基因突变。进一步评估T2和T3后代时，发现具有纯合性和无转基因成分的突变体，其每穗粒数显著增加。到了T4代，突变体表现出二次枝条数量增加22.8%、每穗穗粒数增加34.8%以及单株产量增加35.25%。这表明*An-1*是一个有潜力用于提升水稻产量的新候选基因。

水稻的产量是一个复杂的性状，受多个组成性状的影响，如每株稻穗数、稻穗大小、每穗粒数和粒重。其中，每穗粒数是影响产量的关键因素之一，受到稻穗长度、一次和二次枝条数量以及填充粒比例的调控。已有研究表明，一些主要的产量基因如*Gn1a*、*DEP1*、*DEP3*、*APO1*、*GS3*、*GW5*、*PROG1*、*LRK1*、*OsSPL14*、*EP3*和*SP1*，通过调控每穗粒数，对产量有重要影响。例如，*OsSPL14/IPA1*和*DEP1*基因调控稻穗分支，而*Gn1a*基因编码一种细胞分裂素氧化酶，其表达减少会导致细胞分裂素在花序分生组织中积累，从而加快细胞分裂，最终提高每单位面积的粒数，进而提升产量。

在本研究中，发现一个与产量相关的QTL Awn-1，其中包含调控芒长度的驯化基因*An-1*。*An-1*的序列多态性与现代品种中芒的缩短或无芒以及每穗粒数的增加有关，这使得*An-1*成为驯化的标志。基于这一发现，我们假设*An-1*的新等位基因可能具有降低活性或敲除功能，从而提升每穗粒数，进而提高产量。因此，本研究旨在通过CRISPR/Cas9基因编辑技术创建*An-1*的新等位基因，并将其应用于实际的育种项目中。

为了实现这一目标，我们首先对水稻中183个bHLH基因家族成员的核苷酸序列进行了系统分析，以评估*An-1*（LOC_Os04g28280）与其他*OsbHLH*成员之间的系统发育关系。通过MEME程序识别了这些基因的保守结构域，并使用MEGA 12软件通过邻接法构建了系统发育树，得到了27个基于至少50%支持率的簇。*An-1*被归类到IVb簇，具有独特的长度（263个氨基酸）和结构域特征，包括三个主要的结构域。这一分析为后续基因编辑提供了理论基础和方向指导。

接下来，我们选择了流行的*indica*品种ASD 16作为材料，通过CRISPR/Cas9技术在*An-1*基因的编码区设计了两个sgRNA，分别针对第一（59–81号核苷酸）和第二（77–99号核苷酸）外显子。为了评估sgRNA的特异性，我们将所有IVb簇成员的基因组序列与sgRNA进行了比对，发现设计的sgRNA高度匹配LOC_Os04g28280，确认了其对*An-1*基因的精准靶向。两个sgRNA分别被克隆到二元载体pRGEB31中，并通过冻融法导入*Agrobacterium tumefaciens*菌株LBA4404，用于植物转化。这一过程通过实验室的严格操作和筛选，确保了基因编辑的有效性和安全性。

在基因编辑过程中，我们利用*Agrobacterium*介导的转化方法对ASD 16的未成熟胚进行处理。这些胚被收集于开花后12–15天的成熟穗中，经过无菌分离、短暂热休克处理（43°C，30分钟）以及冰冷却处理后，被转移到愈伤组织增殖培养基中。经过五天的休眠期后，再进行第二次休眠期，以促进愈伤组织的生长。通过两轮选择（50 mg/L 氢霉素和250 mg/L 头孢他啶），我们筛选出可能的转基因植株，并通过1 mg/L NAA和3 mg/L BAP加谷氨酰胺（30 mg/L）进行再生，随后在含有30 mg/L 氢霉素的半强度MS培养基中生根。这些转基因植株在温室条件下进行了强化和适应性培养，以确保其在田间环境下的稳定性。

在分子层面，我们对转基因植株进行了基因组DNA提取，并使用CTAB方法进行PCR分析。通过使用载体特异性引物，我们确认了所有312个转基因植株均含有预期的1.3 kb片段。进一步地，我们使用针对*An-1*基因的引物，对靶向区域进行了扩增和测序，以识别具体的突变。利用ICE v2 CRISPR分析工具和DSDecode软件，我们检测到不同类型的突变，包括多重等位、双等位和单等位突变。此外，我们还预测了*An-1*外显子1的sgRNA的潜在脱靶位点，并通过PCR和Sanger测序确认了转基因植株中没有意外的靶向现象。这些结果表明，我们的基因编辑方法在特异性和效率方面表现良好，为后续的产量提升奠定了基础。

在遗传传递方面，我们评估了CRISPR/Cas9诱导的突变在不同世代中的稳定性。通过将11个T0代植株的后代推进到T1代，我们发现其中的突变能够稳定地遗传给后代。在T2代，我们鉴定出31个纯合突变体、7个双等位突变体和3个多等位突变体，同时也有9个野生型植株。进一步推进到T3代后，我们发现86个脱靶的突变体，并在其中确认了26个达到纯合状态的突变体。最终，我们选择了5个脱靶的纯合突变体推进到T4代，进行产量和农艺性状的评估。在T4代中，突变体表现出显著的产量提升，包括二次枝条数量增加22.8%、每穗穗粒数增加34.8%以及单株产量增加35.25%。这些结果表明，通过*An-1*基因的编辑，我们成功地提升了水稻的产量潜力。

在实际应用中，这些突变体不仅在产量上表现出显著优势，还在其他农艺性状上具有积极影响。例如，突变体在开花时间上比野生型提前了5–6天，这有助于在生长季节内更有效地利用光照和养分。此外，突变体的旗叶长度、稻穗长度和稻穗形态也发生了变化，其中部分突变体的旗叶长度与野生型相似，而其他突变体则表现出显著的减少。这些变化表明，*An-1*基因的调控不仅影响了稻穗的结构，还可能通过影响细胞分裂和生长调控机制，对水稻的整体生长和产量产生积极影响。

在研究过程中，我们还对基因编辑的效率进行了统计分析。在针对第一外显子的实验中，突变效率为42%，而在针对第二外显子的实验中，突变效率达到了100%。这一结果表明，第二外显子的突变效率更高，可能与其基因结构和调控机制有关。此外，我们还发现，不同的突变类型（如插入、缺失和多重突变）在不同世代中表现出不同的遗传稳定性，其中一些突变体在T3和T4代中保持了较高的稳定性，而另一些则需要进一步的筛选和优化。

综上所述，本研究通过CRISPR/Cas9技术成功创建了*An-1*基因的新型等位基因，并验证了这些突变在提升水稻产量方面的潜力。这些突变体不仅在产量上表现出显著优势，还在其他农艺性状上具有积极影响。通过这一研究，我们为水稻产量的持续提升提供了新的遗传资源，并为未来的育种项目提供了重要的参考。此外，本研究还展示了基因编辑技术在作物改良中的巨大潜力，特别是在提升产量、品质和抗逆性方面。随着技术的不断发展，我们有理由相信，基因编辑将成为未来农业发展的重要工具，为实现粮食安全和可持续发展提供强有力的支持。