基于纳米孔测序技术的FMR1基因5'UTR超高GC区CGG重复扩增检测新策略

本研究针对脆性X综合征(FXS)诊断中FMR1基因5'UTR区超高GC含量的CGG重复序列检测难题，开发了长片段超高GC-PCR结合牛津纳米孔测序(ONT)的创新方法。研究在63例样本中实现与TP-PCR/Southern blot 100%一致性检测(R2>0.98)，为同时检测CGG重复扩增(55-200为pre-mutation，>200为full mutation)、点突变和缺失提供了一体化解决方案，对亨廷顿病等短串联重复(STR)相关疾病的检测具有示范意义。

　　

脆性X综合征(Fragile X syndrome, FXS)作为最常见的X连锁智力障碍疾病，其诊断难点在于FMR1基因5'非翻译区(5'UTR)那段"顽固"的CGG重复序列——这段富含GC的区域就像基因组的"沙漠地带"，常规测序技术在此屡屡受挫。目前临床依赖的三引物重复引物PCR(TP-PCR)和Southern blot只能检测重复扩增，而二代测序(NGS)又因读长短和GC偏好性束手无策。更棘手的是，5-44个重复为normal，45-54为intermediate，55-200是pre-mutation，超过200则发展为full mutation，这种精确分型对预测疾病进展至关重要。

中信湘雅生殖与遗传专科医院的研究团队在《Analytical Biochemistry》发表的研究中，开创性地将长片段超高GC-PCR与牛津纳米孔技术(ONT)联用，攻克了这一诊断困境。他们采用特殊PCR体系扩增包含CGG重复及250bp侧翼序列的靶区，对10株标准细胞系(含normal、intermediate、pre-mutation和full mutation各型)和53例临床样本进行测序分析，仅需5000条reads即可完成精准分型。

关键技术包括：1）优化超高GC含量(>80%)区域的长片段PCR扩增；2）基于纳米孔测序平台ONT的长读长检测；3）采用TP-PCR和Southern blot作为金标准验证。样本来源于Coriell医学研究所的标准细胞系及中信湘雅医院的临床血液样本。

【性能验证】在标准细胞系测试中，男性样本(n=5)R²=0.9996，女性样本(n=5)R²=0.9972，与参考方法高度一致。临床样本中男性(n=26)R²=1.0000，女性(n=25)R²=0.9854，实现100%分型准确率。

【技术优势】相比CRISPR/Cas9富集和ReadUntil功能，该方法简化了操作流程，成本降低约60%。特别值得注意的是，该方法成功克服了女性样本中X染色体随机失活带来的分析挑战。

【应用拓展】研究者指出，该策略可推广至强直性肌营养不良(Myotonic dystrophy)的CTG重复和亨廷顿病(Huntington’s disease)的CAG重复检测。通过多重长片段PCR设计，未来有望实现多种STR疾病的一次性筛查。

这项研究的意义不仅在于建立了FXS的精准诊断新标准，更开创了超高GC重复序列检测的通用技术路线。其"扩增-测序"的简约设计思路，为临床遗传实验室提供了即插即用的解决方案，将推动STR相关疾病的分子诊断进入"单次实验，全面检测"的新阶段。