长链非编码RNA TUG1在R-loop调控中的蛋白质互作组全景解析揭示基因组稳定性维持新机制

本研究针对长链非编码RNA(lncRNA)TUG1在R-loop调控中的分子机制这一关键科学问题，通过CRISPR辅助RNA-蛋白质互作检测技术(CARPID)结合质谱分析，系统鉴定了TUG1在HEK293T细胞中的相互作用蛋白质组。研究发现TUG1在复制应激条件下与25种R-loop相关因子（包括DEAD/DEAH-box RNA解旋酶、PARP1和HNRNPs等）动态结合，揭示了lncRNA通过招募核酸代谢机器维持基因组完整性的新机制，为癌症治疗靶点开发提供理论依据。该成果发表于《The Journal of Biochemistry》。

　　

在细胞生命活动中，基因组稳定性维持是关乎生死存亡的核心命题。近年来，由RNA/DNA杂交体和单链DNA组成的三链核酸结构——R-loop，被证实是导致复制应激和基因组不稳定的"分子地雷"。当这些特殊结构在基因组中异常积累时，会引发DNA双链断裂、染色体易位等灾难性后果，与癌症发生发展密切相关。有趣的是，一类被称为"基因组守护者"的长链非编码RNA(lncRNA)正逐渐崭露头角，它们如同细胞内的"分子脚手架"，通过精确调控R-loop动态平衡来守护基因组安全。其中，牛磺酸上调基因1(TUG1)的表现尤为引人注目——这个在多种癌症中异常高表达的lncRNA，已被证实能缓解复制应激并抑制R-loop过度积累，但其具体作用机制仍笼罩在迷雾之中。

名古屋大学大学院医学系研究科癌症生物学研究室的Jingqi Xie、Miho M. Suzuki等研究人员在《The Journal of Biochemistry》发表的重要研究，首次采用CRISPR辅助RNA-蛋白质互作检测技术(CARPID)这一创新方法，结合高灵敏度质谱分析，系统绘制了TUG1在生理状态和复制应激条件下的蛋白质互作图谱。这项研究犹如为科学界提供了一部"分子相互作用词典"，详细记录了TUG1如何根据细胞状态变化，动态调整其"合作伙伴"名单以应对基因组危机。

研究团队运用三大关键技术：首先通过单分子荧光原位杂交(FISH)和RNA/DNA杂交体特异性抗体S9.6的slot blot技术，证实了TUG1表达与R-loop积累的正相关关系；其次设计三组靶向TUG1不同单链区域的sgRNA，利用CARPID技术实现活细胞内TUG1邻近蛋白质的特异性生物素标记；最后通过高分辨率质谱定量分析，在基础状态和喜树碱(CPT)诱导的复制应激条件下，系统鉴定了与TUG1相互作用的蛋白质组。

TUG1表达受复制应激诱导

研究首先在HEK293T细胞模型中证实，TUG1敲降会显著抑制细胞增殖，而DNA损伤剂CPT处理可使TUG1转录水平提升2倍。通过S9.6抗体检测发现，CPT处理使RNA/DNA杂交体信号增强2.3倍，且该信号可被RNase H特异性降解，证实了R-loop的应激性积累。

CARPID技术揭示TUG1互作组动态变化

研究团队精心设计了三组靶向TUG1不同单链区域的sgRNA（sgTUG1_1/2/3），其切割效率均超过80%。CARPID实验显示，在基础状态下三个sgRNA共同鉴定出17个高置信度的TUG1相互作用蛋白，包括已知的R-loop解旋酶DHX9、PARP1以及多种异质核糖核蛋白(HNRNPs)。值得注意的是，这些蛋白中约65%已被文献报道具有RNA/DNA杂交体结合能力。

应激条件下的互作组扩展

当细胞遭遇CPT诱导的复制应激时，TUG1互作蛋白数量增至25个，且不同sgRNA鉴定结果的重叠率显著提高，提示应激状态下TUG1可能采取更保守的空间构象。新发现的互作蛋白包括另外三种DEAD/DEAH-box解旋酶（DDX3X、DDX5和DHX15）以及拓扑异构酶TOP1。基因本体(GO)分析显示，这些应激诱导的新互作蛋白主要富集于"RNA加工"和"染色质组织"等通路，其中组蛋白变体H2B和H2A的互作强度在应激条件下分别提升了120倍和3.7倍。

这项研究的重要发现在于揭示了TUG1作为"分子枢纽"的动态调控特性：在基础状态下，它主要与核心R-loop解旋酶（如DHX9、DDX17等）保持互动；而当基因组危机来临时，它能迅速扩充"社交圈"，招募更多染色质重塑因子（如SMARCA5）和DNA损伤应答蛋白（如MDC1）组成应急响应网络。特别值得注意的是，PARP1的持续存在暗示ADP核糖基化修饰可能是TUG1功能调控的关键环节，而拓扑异构酶的加入则揭示了TUG1可能协调转录-复制冲突解决的深层机制。

这些发现不仅完善了我们对lncRNA在基因组稳定性维持中作用机制的理解，更重要的是为癌症治疗提供了新的靶点开发思路——通过调控TUG1及其互作蛋白网络来精准干预R-loop动态平衡，有望成为克服肿瘤化疗耐药性的新策略。正如研究者指出，这种CRISPR辅助的互作组解析方法，为揭示其他lncRNA的分子功能提供了可借鉴的技术范式，将推动非编码RNA研究进入"高精度互作图谱"的新时代。